Toxicologie Generala Corectata Format Final

Felicia Loghin

TOXICOLOGIE GENERALĂ

Editura Medicală Universitară „Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca 2002

CUPRINS INTRODUCERE ÎN TOXICOLOGIE Definiţie şi scop Istoricul toxicologiei

1 1 4

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII Substanţe toxice: definiţie, clasificare Intoxicaţii: definiţie, clasificare 1. Clasificarea conform criteriului clinico-evolutiv 2. Clasificarea conform criteriului social-juridic

8 8 9 9 11

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ Mecanisme de transport prin membranele biologice Absorbţia substanţelor toxice 1. Absorbţia digestivă 2. Absorbţia pe cale respiratorie 3. Absorbţia cutanată 4. Absorbţia parenterală Distribuţia substanţelor toxice Stocarea substanţelor toxice Eliminarea substanţelor toxice 1. Excreţia renală 2. Excreţia prin fecale 3. Eliminarea pulmonară 4. Alte căi de eliminare Metabolizarea substanţelor toxice Reacţii din faza I 1. Reacţii de oxidare A. Sistemul enzimatic al monooxigenazelor dependente de citocromul P450 B. Flavinmonooxigenaza C. Oxidările nemicrozomale 2. Reacţii de reducere A. Reduceri microzomale B. Reduceri nemicrozomale

19 19 28 28 33 36 38 38 41 43 43 45 46 47 47 51 51 51 61 62 64 65 66

3. Reacţii de hidroliză Reacţii din faza II 1. Glucuronoconjugarea 2. Sulfoconjugarea 3. Conjugarea cu aminoacizi 4. Acetilarea 5. Conjugarea cu glutation 6. Metilarea Rezultatul biotransformării xenobioticelor 1. Inducţia enzimatică 2. Inhibiţia enzimatică 3. Bioactivarea

67 68 68 69 70 71 72 72 74 74 75 76

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE Riscul şi evaluarea riscului

88 92

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA Factori chimici care influenţează toxicitatea Factori biologici care influenţează toxicitatea Factori de mediu care influenţează toxicitatea

97 97 103 117

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ Afectarea structurii celulare Moartea celulară A) Acţiunea caustică B) Formarea de reactivi intermediari Tulburări ale funcţiei celulare induse de substanţele toxice Disfuncţii ale exprimării genice Disfuncţii ale activităţii celulare în desfăşurare Afectarea homeostaziei celulare Genotoxicitatea Teste de mutageneză Carcinogeneza chimică Patogeneza cancerului Carcinogene chimice Teratogeneza Imunotoxicitatea Imunosupresia Stimularea răspunsului imun Autoimunitatea

124 128 128 130 130 139 140 141 141 143 147 150 151 156 161 165 167 168 173

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ Patologia toxică a sistemului nervos Neuronopatii Axonopatii Mielinopatii Tulburări ale transmiterii impulsului nervos Miopatii Vasculopatii toxice Patologia toxică a funcţiei pulmonare Efecte sistemice Efecte pulmonare Efecte asupra căilor respiratorii superioare Efecte pulmonare după expunere pe o altă cale Patologia toxică a ficatului Leziuni citotoxice acute Leziuni colestatice Hepatopatii cronice Patologia toxică a rinichiului Insuficienţa renală acută Insuficienţa renală cronică Sindromul nefrotic Patologia toxică a sângelui şi a măduvei hematoformatoare Afectarea hematopoezei Afectarea sângelui periferic Patologia toxică a pielii

177 177 183 186 189 190 191 191 191 192 194 197 197 198 200 201 202 203 205 205 206 207 207 209 210

BIBLIOGRAFIE

213

INTRODUCERE ÎN TOXICOLOGIE DEFINIŢIE ŞI SCOP Toxicologia poate fi definită ca ştiinţa care studiază efectele dăunătoare ale substanţelor chimice asupra organismelor, precum şi interacţiunile acestora cu organismele vii. Într-un sens mai larg, ea a fost definită ca ştiinţa care se ocupă cu identificarea, izolarea şi determinarea cantitativă a substanţelor toxice, cu acţiunea lor asupra organismului, precum şi cu mijloacele folosite pentru combaterea efectelor toxice (Gonzales, 1954). Etimologia cuvântului toxic provine din greaca antică, în care toxon însemna arc, săgeată sau otrava cu care era tratat vârful săgeţilor. După Pliniu, termenul toxicus derivă de la taxus, o specie de conifere ale cărei fructe se foloseau la otrăvirea săgeţilor. Cuvântul otravă provine de la verbul slav otraviti, care înseamnă a mâhni, a tulbura seninătatea sufletească. Sfera noţiunii de otravă este mai restrânsă decât a aceleia de toxic şi se referă la substanţele folosite în scop criminal. Toxicologia este o ştiinţă pluridisciplinară, care necesită cunoştinţe de farmacologie, biochimie, chimie, fiziologie, patologie şi deşi a fost adesea considerată drept o componentă a acestora, ea este o disciplină ştiinţifică de sine stătătoare. Toxicologia este o ştiinţă experimentală, cu un caracter aplicativ pronunţat. Rolul său în serviciul societăţii constă în primul rând în protejarea oamenilor şi a altor organisme împotriva efectelor dăunătoare ale substanţelor toxice, dar şi în dezvoltarea unor compuşi din clasa medicamentelor anticanceroase sau a pesticidelor care să prezinte o toxicitate mai selectivă şi deci o mai mare securitate în utilizare. Scopurile toxicologiei moderne sunt multiple, iar clasificările diferiţilor autori sunt mai mult sau mai puţin detaliate. Astfel, Loomis şi Hayes (1996) definesc trei domenii principale de interes: toxicologia mediului, toxicologia economică şi toxicologia medicală (Fig.1.1). Prima se ocupă cu reziduurile, poluarea şi igiena industrială, a doua cu dezvoltarea de noi substanţe chimice utilizabile ca medicamente, pesticide şi aditivi alimentari, iar ultima cu diagnosticul şi tratamentul intoxicaţiilor şi cu aspectele medico-legale ale acestora. Hodgson şi Levi (1997) propun o clasificare mai detaliată, care evidenţiază foarte clar domeniile de interes ale toxicologiei şi importanţa acesteia în societatea modernă. Cele cinci grupe principale studiază:

2 • TOXICOLOGIE GENERALA

FARMACOLOGIE

PATOLOGIE INGINERIE

CHIMIE

SANATATE PUBLICA

BIOLOGIE FIZIOLOGIE

IMUNOLOGIE

TOXICOLOGIA

MEDIULUI

ECONOMICA

POLUARE ATMOSFERICA A SOLULUI MARINA

SUBSTANTE INDUSTRIALE ALIMENTE SI ADITIVI ALIMENTARI MEDICAMENTE SI COSMETICE CERCETARE FUNDAMENTALA

MEDICALA DIAGNOSTIC TERAPIE MEDICO-LEGALA BOLI PROFESIONALE

Fig. 1.1. Domeniile de interes ale toxicologiei şi disciplinele conexe (Loomis şi Hayes, 1996)

A. Mecanismele de acţiune toxică 1. Toxicologia biochimică – se ocupă cu evenimentele ce au loc la nivel biochimic şi molecular, incluzând enzimele de metabolizare a xenobioticelor, generarea intermediarilor reactivi, interacţiunea cu macromoleculele, aspecte de biologie moleculară 2. Toxicologia comportamentală – studiază efectele substanţelor toxice asupra comportamentului uman şi animal 3. Toxicologia nutriţională – studiază efectele dietei asupra toxicităţii 4. Carcinogeneza – se ocupă cu evenimentele chimice şi biochimice care conduc la apariţia cancerului 5. Teratogeneza – studiază evenimentele chimice şi biochimice care conduc la efecte dăunătoare asupra procesului de dezvoltare 6. Mutageneza – se ocupă cu efectele toxice asupra materialului genetic 7. Toxicitatea la nivelul organelor – studiază efectele substanţelor toxice asupra funcţionalităţii organelor

INTRODUCERE ÎN TOXICOLOGIE •

3

B. Măsurarea substanţelor toxice şi a toxicităţii 1. Toxicologia analitică – este o ramură a chimiei analitice care se ocupă cu identificarea şi determinarea cantitativă a substanţelor toxice şi a metaboliţilor acestora în produse biologice şi în probe de mediu 2. Evaluarea toxicologică – implică utilizarea organismelor vii pentru estimarea efectelor toxice 3. Patologia toxicologică – este o ramură a patologiei care se ocupă cu efectele substanţelor toxice manifestate prin modificări ale morfologiei subcelulare, celulare, tisulare sau la nivel de organ 4. Studii structură-activitate – studiază relaţiile între proprietăţile fizicochimice ale substanţelor toxice şi toxicitatea acestora şi în special utilizarea acestor relaţii pentru prevederea toxicităţii. C. Toxicologie aplicată 1. Toxicologia clinică – se ocupă cu diagnosticul şi tratamentul intoxicaţiilor la om 2. Toxicologia veterinară – studiază diagnosticul şi tratamentul intoxicaţiilor la animale, în special la cele de companie şi la cele care reprezintă surse de produse alimentare 3. Toxicologia medico-legală – urmăreşte diagnosticarea intoxicaţiilor letale, inclusiv prin detectarea otrăvurilor în probele biologice provenite de la intoxicaţi 4. Ecotoxicologia – studiază contaminarea mediului înconjurător cu poluanţi, comportarea poluanţilor în biosferă şi efectele nocive ale acestora asupra ecosistemelor. 5. Toxicologia industrială – reprezintă un domeniu specific al toxicologiei mediului, care se ocupă de mediul de muncă. D. Toxicologia unor clase de substanţe chimice cu anumite utilizări: include aspectele toxicologice ale dezvoltării de noi substanţe cu utilizări comerciale specifice: 1. Substanţe chimice utilizate în agricultură – insecticide, ierbicide, fungicide, rodenticide. Se urmăreşte dezvoltarea de substanţe cu toxicitate selectivă, adică maximă faţă de organismele ţintă şi minimă faţă de celelalte organisme din mediu sau faţă de om. 2. Medicamente – evaluarea toxicităţii şi a efectelor adverse 3. Droguri 4. Aditivi alimentari 5. Substanţe chimice industriale 6. Substanţe naturale: fitotoxine, micotoxine, minerale 7. Produşi de combustie

4 • TOXICOLOGIE GENERALA

E. Toxicologie reglementară – se preocupă de formularea unor acte legislative care au drept scop reducerea efectelor toxice ale substanţelor asupra sănătăţii omului sau asupra mediului 1. Aspectele legale – se referă la formularea de legi şi regulamente şi la aplicarea acestora 2. Evaluarea riscului – constă în definirea riscurilor, a riscurilor potenţiale şi în stabilirea raportului beneficiu / risc, servind la adoptarea măsurilor legislative.

ISTORICUL TOXICOLOGIEI Toxicologia este o ştiinţă experimentală, ale cărei începuturi se pierd în negura timpurilor, dezvoltarea sa fiind strâns legată de drama otrăvirilor, care a marcat evoluţia societăţii umane de la începuturile ei până în epoca modernă. Omul primitiv, aflându-se în contact direct cu natura, a început să cunoască elementele din regnul mineral, vegetal şi animal, diferenţiind produsele toxice de cele folositoare pentru alimentaţie. El cunoştea efectele toxice ale veninului de şarpe, plantelor otrăvitoare cum ar fi cucuta sau aconitul, precum şi ale unor substanţe minerale ca arsenul, plumbul, mercurul, stibiul, cuprul. Unele din acestea erau folosite în scopuri criminale sau de suicid. Papirusul egiptean Ebers (aproximativ 1500 Î.C.) poate fi considerat drept cea mai veche farmacopee care a supravieţuit şi conţine informaţii despre numeroase otrăvuri, printre care cucuta, aconitul, opiul, plumbul, cuprul, stibiul, glicozidele cianogenetice. Aceste otrăvuri erau considerate a avea proprietăţi mistice şi utilizarea lor era înconjurată de superstiţii. Se considera de exemplu că ingestia acestor substanţe era letală pentru cei vinovaţi şi fără efecte pentru cei inocenţi. Astfel, în Egiptul antic soţiile infidele erau supuse „pedepsei piersicilor”, care presupunea administrarea sâmburilor zdrobiţi de piersici ce conţin amigdalină, substanţă care eliberează în organism cianură. Sumerienii, în jurul anilor 4500 Î.C., se închinau la zeiţa Gula, care era considerată drept stăpâna farmecelor, vrăjilor şi a otrăvurilor. Folosirea săgeţilor otrăvite este cunoscută din cele mai vechi timpuri. Vânătorii preistorici Masai din Kenia, care au trăit acum 18.000 de ani, foloseau săgeţi otrăvite, probabil cu extracte din specii de Strophanthus. Referire la săgeţile otrăvite se face şi în textul indian Rig Veda (sec.XII Î.C.), în Odiseea lui Homer (850 Î.C.) şi în Cartea lui Iov. Primele încercări de identificare şi clasificare a otrăvurilor, precum şi de introducere a unor antidoturi, au fost semnalate în Grecia şi Roma antică. Theophrastus (370-286 Î.C.), un student al lui Aristotel, a inclus numeroase referinţe la plantele otrăvitoare în lucrarea sa De Historia Plantarum. Dioscorides

INTRODUCERE ÎN TOXICOLOGIE •

5

(40-80 D.C.), un medic grec care a trăit la curtea împăratului Nero, a făcut prima încercare de a clasifica otrăvurile în funcţie de originea lor: animale, vegetale şi minerale, clasificare care s-a păstrat timp de 15 secole. Nicander din Colophon (204-135 Î.C.), un medic şi poet grec, este considerat a fi unul din primii toxicologi şi a experimentat toxinele animale pe criminalii condamnaţi. În poemul său „Theriaca” a descris simptomele şi tratamentul otrăvirilor cu toxine animale, iar în poemul „Alexipharmaca” vorbeşte despre antidoturi. Otrăvirile intenţionate au fost foarte frecvente în antichitate, atât în execuţii cât şi pentru eliminarea oponenţilor politici. Poate cel mai cunoscut caz de utilizare a otrăvii ca modalitate de execuţie este cel al filozofului grec Socrates (470-399 Î.C.), care a fost executat prin administrarea unui extract de cucută (Conium maculatum). Una din cele mai infame otrăvitoare din toate timpurile a fost Locusta, care a fost angajată de Agrippina, mama lui Nero, pentru a-i asigura acestuia accesul la tron. Recunoaşterea, clasificarea şi utilizarea otrăvurilor în Grecia antică şi în Roma antică au fost însoţite de o căutare neobosită a unui antidot universal. În acest sens, un loc aparte în istoria toxicologiei îl ocupă legenda regelui Mithridates al VIlea al Pontului, ale cărui numeroase experienţe de toxicitate acută pe criminali l-au făcut să pretindă că a descoperit un antidot pentru fiecare reptilă veninoasă sau substanţă otrăvitoare. Teama sa de a nu fi otrăvit era atât de mare, încât ingera regulat un amestec de 36 de ingrediente pentru a se proteja împotriva unui asasinat. Datorită efectului acestui amestec de antidoturi, încercarea de a se sinucide cu otravă cu ocazia capturării sale iminente de către inamici a eşuat şi a fost nevoit să apeleze la sabia unui servitor. Un alt antidot folosit în Roma antică a fost Theriacum, preparat de medicul lui Nero, Andromachus. Acesta a adăugat la antidotul regelui Mithridate, Mithridatum, ingrediente cum ar fi carnea de vipere, ceapa de mare şi cantităţi mari de opiu, iar alte ingrediente au fost îndepărtate. Numărul total de componente era de 75 şi se presupunea că acest antidot ar fi fost eficient în contracararea tuturor otrăvurilor şi a muşcăturilor de animale veninoase. Între căderea Romei şi secolul al XII-lea D.C., subiectul otrăvurilor este rar întâlnit în documente. Prima evaluare critică a antidoturilor se regăseşte în lucrarea medicului şi filozofului evreu Maimonides (Moses ben Maimon, 1135-1204) intitulată „Tratat despre otrăvuri şi antidoturile lor” (1198), care marchează intrarea într-un nou stadiu al dezvoltării toxicologiei. Maimonides, ca şi Hippocrates înaintea sa, a scris despre biodisponibilitate, menţionând că laptele, untul şi smântâna pot să scadă absorbţia intestinală. El a respins unele din tratamentele populare ale timpului, dar a continuat să susţină utilizarea theriacului şi a mithridatului în tratamentul muşcăturilor de şarpe. Începând din secolul al XV-lea, otrăvirea criminală a fost practicată din ce în ce mai des în Italia, care devine leagănul crimei prin otrăvire. O figură infamă a acestui timp este otrăvitoarea Toffana, care prepara cosmetice pe bază de arsen

6 • TOXICOLOGIE GENERALA

(Agua Toffana). Ea a fost succedată de o imitatoare cu geniu organizatoric, Hieronyma Spara, care şi-a dirijat activităţile spre obiective maritale şi financiare specifice. Printre familiile care au fost implicate în cazuri de otrăvire, cea mai faimoasă este familia Borgia, care folosea o otravă numită „la cantarella”, un amestec de arsen şi fosfor. Activitatea lui Alexandru VI, a fiului său Cesare şi a Lucreţiei Borgia a contribuit la creşterea considerabilă a proprietăţilor statului papal. Catherina de Medici a exportat cunoştinţele sale în domeniul otrăvirilor din Italia în Franţa. Sub faţada îngrijirii celor săraci şi bolnavi, ea a testat diferite amestecuri toxice sub aspectul simptomatologiei, momentului de instalare a acesteia şi locului de acţiune. O urmaşă notorie a acesteia a fost marchiza de Brinvilliers, iar momentul culminant al acestei practici în Franţa este reprezentat de Catherine Deshayes, supranumită „La Voisine”, care îşi oferea serviciile contra unor sume de bani şi care a fost condamnată pentru foarte multe cazuri de otrăviri, printre victimele sale numărându-se peste 2000 de copii. Bazele ştiinţifice ale toxicologiei au fost puse în epoca iluministă de către medicul şi alchimistul elveţian Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim-Paracelsus (1493-1541). Afirmaţia sa: „Toate substanţele sunt otrăvuri; nu există nici una care să nu fie otravă. Doza potrivită diferenţiază o otravă de un remediu” rămâne şi astăzi principiul de bază al toxicologiei, contribuind la dezvoltarea conceptelor de „relaţie doză-efect” şi de „indice terapeutic”. De asemenea, în cartea sa Bergsucht (1533-1534), Paracelsus descrie manifestările clinice ale intoxicaţiilor cronice cu arsen şi mercur, precum şi „boala minerilor”. Preocupările în domeniul toxicologiei ocupaţionale au fost continuate de Bernardino Ramazzini care a publicat în 1700 lucrarea „Discurs cu privire la bolile muncitorilor”. Revoluţia industrială a condus la apariţia mai multor boli profesionale. Astfel Sir Percival Pott a recunoscut în 1775 rolul funinginei în apariţia cancerului scrotului la coşari. Părintele toxicologiei poate fi considerat medicul şi chimistul spaniol Mateo José Buenaventura Orfila (1787-1853), care a fost profesor de medicină legală la Universitatea din Paris. El a descris Toxicologia drept o disciplină ştiinţifică diferită de medicina clinică şi de farmacologie şi a militat pentru utilizarea analizei chimice şi a materialului de autopsie ca dovezi în intoxicaţiile criminale. În 1814 publică „Tratatul de toxicologie” în care pune bazele toxicologiei experimentale şi medico-legale. Alte nume importante în dezvoltarea toxicologiei experimentale sunt François Magendie (1783-1855) care a studiat mecanismul de acţiune toxică al emetinei, stricninei şi cianurii. Elevul său, Claude Bernard (1813-1878), a avut contribuţii importante la descifrarea acţiunii toxice a monoxidului de carbon şi a curarei. Tratatul lui Bernard, „O introducere în studiul medicinei experimentale”, face parte din literatura clasică în dezvoltarea toxicologiei.

INTRODUCERE ÎN TOXICOLOGIE •

7

În domeniul toxicologiei analitice, s-a urmărit elaborarea unor metode pentru distrugerea materiei organice şi pentru izolarea şi identificarea substanţelor toxice din produsele biologice. Astfel, numele chimistului englez James Marsh este legat de elaborarea unei tehnici pentru decelarea arsenului (1836), iar cel al chimistului german Stas de izolarea nicotinei din probe biologice (1851). Fresenius în 1845 şi von Babo în 1847, dezvoltă o metodă de screening pentru toxicii necunoscuţi, Selmi şi Armand Gauthier descoperă ptomainele, iar Ogier glicozizii cadaverici. O contribuţie importantă a fost adusă de Chelle în problema otrăvurilor cianhidrice, prin descoperirea acidului cianhidric disimulat. Dezvoltarea toxicologiei în secolul XX este tot mai rapidă şi interesează tot mai multe domenii. Progresele din chimia analitică înregistrate după 1945 au făcut posibilă evoluţia fără precedent a toxicologiei analitice. Episodul talidomidei a determinat înăsprirea legislaţiei în domeniul evaluării toxicologice a medicamentelor, iar publicarea cărţii lui Rachel Carson, „Silent Spring” (1962), a evidenţiat efectele utilizării pesticidelor asupra mediului, contribuind la apariţia ecotoxicologiei. A crescut preocuparea pentru descifrarea mecanismelor prin care se produc efectele toxice şi pentru stabilirea relaţiilor care există între proprietăţile fizico-chimice şi toxicitate. S-a dezvoltat toxicologia clinică şi au apărut noi antidoturi care acţionează prin mecanisme specifice. A crescut preocuparea pentru prevenirea intoxicaţiilor, atât a celor profesionale cât şi a celor medicamentoase, prin apariţia „Centrelor pentru prevenirea intoxicaţiilor”. În ţara noastră, încă înainte de înfiinţarea învăţământului farmaceutic, au existat farmacişti care au desfăşurat activităţi în domeniul toxicologiei. Primul toxicolog poate fi considerat farmacistul şi medicul Constantin Hepites, care a avut din 1833 un laborator de analize chimico-legale la Brăila şi care a devenit ulterior profesor la Şcoala Naţională de Farmacie din Bucureşti. După 1890, toxicologia românească a fost reprezentată de medicul şi farmacistul Mina Minovici, care a publicat lucrări în domeniul ptomainelor, iar fratele său, Ştefan Minovici, a publicat în 1912 un manual de toxicologie. Alţi farmacişti care au contribuit la dezvoltarea toxicologiei româneşti au fost: Bacovescu, Vintilescu, Deleanu, Al. Ionescu-Matiu, N. Ioanid, V. Galea, M. Cotrău.

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII SUBSTANŢE TOXICE: DEFINIŢIE, CLASIFICARE Substanţa toxică reprezintă obiectul de studiul al toxicologiei şi poate fi definită drept orice compus chimic capabil să producă alterări structurale şi funcţionale la diferite niveluri de organizare a materiei vii, alterări care se exprimă pe plan clinic printr-o stare patologică, care poate să fie reversibilă sau nu. Această definiţie se referă la compuşii chimici exogeni, care pătrund în organism din mediul exterior şi care poartă denumirea de xenobiotice. În principiu, conceptele de substanţă toxică şi de otravă sunt sinonime, dar în realitate primul are un caracter general, în timp ce al doilea este utilizat atunci când folosirea compusului este intenţionată, în special în scop criminal. Cea mai veche clasificare a substanţelor toxice datează din vremea lui Dioscorides, care le clasifica după originea lor în substanţe vegetale, animale sau minerale. În zilele noastre, se disting trei grupe de substanţe toxice în funcţie de origine: Ø Compuşi organici de sinteză: o Poluanţi din aer, apă, alimente: CO, oxizi de azot, oxizi de sulf, hidrocarburi, particule, deşeuri industriale, pesticide, fertilizanţi o Aditivi alimentari: conservanţi, antioxidanţi, coloranţi o Substanţe chimice din mediul de muncă: metale grele, fluoruri, monoxid de carbon, hidrocarburi, alcooli, esteri, compuşi organometalici, nitro- şi aminoderivaţi o Droguri: deprimante ale SNC, stimulante, halucinogene, etc o Medicamente o Pesticide o Solvenţi: hidrocarburi alifatice, hidrocarburi halogenate, alcooli alifatici, glicoli, hidrocarburi aromatice o Hidrocarburi aromatice policiclice o Cosmetice Ø Toxine naturale: o Micotoxine: aflatoxine, tricocetene, etc o Toxine microbiene: toxina botulinică, toxina tetanică, etc o Toxine din plante (fitotoxine): alcaloizi, glicozide, etc o Toxine animale: veninuri de şerpi, veninuri din insecte

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII •

9

Ø Substanţe anorganice: metale Alte criterii de clasificare ţin cont de organul ţintă asupra căruia acţionează substanţa, de mecanismul de acţiune, sau de toxicitatea compuşilor. Astfel, în Uniunea Europeană, substanţele toxice sunt clasificate în 4 clase de toxicitate, pe baza valorii dozei medii letale (DL50) determinate la şobolani (Tabel II.1.): Tabel II.1.: Clasele de toxicitate în Uniunea Europeană Intervalul DL50 (mg / kg) DL50 ≤ 25 25 < DL50 ≤ 200 200 < DL50 ≤ 2000 2000 < DL50

Clasa de toxicitate Foarte toxice Toxice Dăunătoare Neclasificate

INTOXICAŢII: DEFINIŢIE, CLASIFICARE Intoxicaţia este răspunsul organismului la pătrunderea unei substanţe toxice. Ea reprezintă o stare patologică, reversibilă sau nu, care se traduce printr-o modificare a structurilor celulare sau a metabolismului celular. Intoxicaţiile se pot clasifica după două criterii principale: Ø criteriul clinico-evolutiv ⇒ - intoxicaţii acute - intoxicaţii cronice Ø criteriul social-juridic ⇒ - intoxicaţii voluntare = intenţionate - intoxicaţii involuntare = accidentale

1. Clasificarea conform criteriului clinico-evolutiv 1.1. Intoxicaţiile acute apar în urma pătrunderii în organism a substanţei toxice în doză relativ mare, o singură dată sau de mai multe ori într-un interval de 24 de ore. Simptomatologia apare în general brusc, este bine conturată şi evoluează rapid. Există însă şi substanţe toxice cum ar fi fosforul, taliul sau paraquatul, în cazul cărora simptomatologia nu se instalează decât după câteva zile sau săptămâni de la absorbţie. Evoluţia poate conduce la decesul intoxicatului sau la recuperarea

10 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

totală sau parţială a acestuia. În ultimul caz pot să rămână sechele sau leziuni persistente. Dependent de doza absorbită şi de modul de evoluţie, intoxicaţiile acute pot fi subclasificate la rândul lor în: Ø intoxicaţii supraacute Ø intoxicaţii acute propriu-zise Ø intoxicaţii subacute Intoxicaţiile supraacute survin în urma absorbţiei unor doze mai mari decât dozele letale, simptomatologia fiind aproape instantanee şi apărând la câteva minute sau ore de la expunere. De cele mai multe ori aceste intoxicaţii sunt letale. Intoxicaţiile subacute survin în urma absorbţiei unor doze mici de substanţă toxică, simptomatologia este moderată, apare după o perioadă de latenţă, iar uneori este subclinică, fără manifestări evidente, chiar dacă se produc perturbări la nivele biologice distincte. Intoxicaţiile acute sunt în ţările dezvoltate una din principalele cauze de spitalizare a persoanelor sub 30 de ani. Se constată că frecvenţa acestor intoxicaţii este de peste 50% la sexul feminin, că grupa de vârstă cea mai afectată este cea sub 13-14 ani, că peste 80% din intoxicaţii se produc la domiciliu şi peste 70% sunt accidentale. Clasele de substanţe implicate în producerea intoxicaţiilor pot să difere de la o ţară la alta, în funcţie de gradul de industrializare sau caracteristicile culturale. Astfel, în ţările dezvoltate sunt mai frecvente intoxicaţiile cu medicamente (analgezice, antidepresive, sedative-hipnotice, stimulante şi droguri, medicamente cardiovasculare), în timp ce în ţările în curs de dezvoltare se întâlnesc mai ales intoxicaţii cu produse agricole (pesticide, ciuperci otrăvitoare) sau produse industriale (alcool metilic, produse petroliere) şi menajere (sodă caustică, detergenţi, decapanţi, solvenţi, etc.). 1.2. Intoxicaţiile cronice se produc în urma absorbţiei repetate de doze mici de substanţă toxică. Acţiunea toxică se datorează fie acumulării substanţei în organism, la nivelul diferitelor organe sau ţesuturi, fie sumării efectelor lezionale în decursul timpului, cu apariţia unor stări patologice. Modificările care apar sunt adesea latente (subclinice), dar pot să devină manifeste în cazul scăderii condiţiei fiziologice generale sau a mobilizării substanţei toxice din depozite, când se produce o intoxicaţie acută prin creşterea nivelelor sanguine ale toxicului. Cauzele cele mai frecvente ale intoxicaţiilor cronice sunt utilizarea necorespunzătoare a medicamentelor, produselor industriale şi pesticidelor, contaminarea mediului şi toxicomaniile.

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII •

11

2. Clasificarea conform criteriului social-juridic 2.1. Intoxicaţii voluntare Din această categorie fac parte: crimele, sinuciderile, toxicomaniile, dopingul şi utilizarea afrodisiacelor. 2.1.1. Crimele prin otrăvire, care în trecut au făcut numeroase victime, au scăzut ca incidenţă o dată cu dezvoltarea unei metodologii eficiente pentru punerea în evidenţă a substanţei toxice implicate. Unele cazuri celebre de otrăvire au contribuit decisiv la progresul toxicologiei analitice (dozarea arsenului, extracţia substanţelor toxice organice, etc). În general, substanţele folosite în scop criminal sunt substanţe cu un potenţial toxic ridicat şi cu proprietăţi fizice care să le confere persistenţă şi care să nu permită decelarea lor de către victimă (fără miros sau gust caracteristic). Printre acestea se numără: - derivaţii de arsen - sărurile de mercur - acizii corozivi - stricnina - stupefiantele - acidul cianhidric şi cianurile - barbituricii şi alte psihotrope - insecticidele organofosforice (în special paration) - fosforul, produsele raticide pe bază de fosfor, fosfura de zinc - aconitina - elementele radioactive, etc. Un loc aparte între intoxicaţiile criminale îl ocupă intoxicaţiile colective ca urmare a folosirii substanţelor toxice de luptă, care fac parte din categoria substanţelor iritante, caustice şi vezicante pe piele şi mucoase (Iperita folosită în primul război mondial), a substanţelor neurotoxice (Somanul, Sarinul), sau a biotoxinelor. 2.1.2. Sinuciderile reprezintă autointoxicaţii acute, de cele mai multe ori cu sfârşit letal. Sinuciderile au fost frecvente în toate timpurile, dar în ultimul secol statisticile indică o creştere a procentului de otrăviri faţă de alte metode de sinucidere. Ele sunt mai frecvente la femei, deşi cazurile letale sunt mai întâlnite la bărbaţi. Grupul de vârstă cel mai afectat este cel între 17 şi 20 de ani. Sinucigaşii caută de obicei substanţe toxice care produc o moarte uşoară (barbiturici, tranchilizante, morfină), iar în lipsa acestora se folosesc substanţe mai uşor accesibile (sodă caustică, acizi, pesticide). Principalele substanţe utilizate în scop suicidar sunt:

12 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

- medicamente psihotrope (hipnotice, antidepresive), asociate sau nu cu alcool - gaz de eşapament (monoxid de carbon) - aspirină - digitalice - pesticide (insecticide, raticide) - cianuri - stricnină - hipoclorit - solvenţi, etc.

anxiolitice,

neuroleptice,

2.1.3. Toxicomaniile sunt intoxicaţii voluntare de tip cronic, determinate de consumarea repetată a unui drog. Conform Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii: „Toxicomania reprezintă o stare psihică, uneori şi fizică, care rezultă din interacţiunea unui organism şi a unui medicament şi care se caracterizează prin modificări de comportament şi alte reacţii, care conţin întotdeauna nevoia de a lua substanţa în mod continuu sau periodic, pentru a resimţi efectele sale psihice şi uneori pentru a evita suferinţele privaţiunii”. Etimologia cuvântului toxicomanie provine din limba greacă, de la toxicon (otravă) şi manie (nebunie). Denumirea toxicomaniei se formează de la numele drogului plus sufixul „manie” (ex. cocainomanie, heroinomanie), sau de la numele drogului plus sufixul „ism” (ex. alcoolism, tabagism). Clasificarea toxicomaniilor se poate face: a) după gravitatea lor: • toxicomanii majore (cu heroină, cocaină, LSD) • toxicomanii minore (cafeism, teism) • toxicomanii de graniţă (tabagism) b) după numărul drogurilor administrate • monotoxicomanii, când se consumă un singur drog • politoxicomanii, când se consumă mai multe droguri În ultima perioadă se constată o creştere marcată a numărului politoxicomaniilor, drogaţii asociind 2, 3 şi chiar 7 droguri. De asemenea, este foarte frecventă asocierea dintre droguri şi alcool. Utilizatorii de droguri sunt în marea lor majoritate tineri, aproximativ 90% între 16 şi 30 de ani, segmentul de vârstă cel mai afectat fiind cel între 21 şi 25 de ani. În funcţie de vârstă, se foloseşte cu predilecţie un anumit drog. Astfel, solvenţii sunt în general utilizaţi de subiecţi foarte tineri, între 8 şi 18 ani, la 14 ani se încearcă tutunul, la 16 ani consumul de alcool, iar la 18 ani consumul de canabis, cocaină, heroină şi halucinogene. Aproximativ 75% din utilizatori sunt băieţi. Toxicomaniile au, în general, patru caracteristici:

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII •

13

1) Dependenţa psihică, care constă în modificări de comportament şi o stare mentală particulară însoţită de necesitatea psihică imperioasă de a-şi administra substanţa periodic sau continuu, pentru a obţine o stare de bine sau pentru a înlătura disconfortul psihic. Este caracteristica principală, care se întâlneşte în toate cazurile de toxicomanie. 2) Dependenţa fizică este o stare patologică ce constă în necesitatea organică de a folosi drogul, în vederea evitării tulburărilor ce apar la întreruperea administrării. 3) Toleranţa reprezintă administrarea unor doze crescute de drog pentru a obţine efectul dorit. Toxicomanii ajung astfel să tolereze doze care produc la persoanele normale efecte foarte grave, sau chiar moarte. Toleranţa nu este o caracteristică obligatorie a unei toxicomanii, ea fiind mai pronunţată la unele droguri (ex. morfină, cocaină), şi absentă la altele (ex. halucinogene). 4) Sindromul de abstinenţă apare la întreruperea administrării substanţei, sau uneori la reducerea importantă a dozelor. El se caracterizează prin tulburări psihice şi organice care se manifestă prin simptome opuse celor produse de drogul în cauză. 2.1.4. Dopingul constă în administrarea de substanţe în scopul creşterii randamentului fizic, intelectual sau sportiv; aceste substanţe pot sau nu să producă dependenţă. Printre principalele clase de compuşi utilizaţi se numără hormonii şi euforizantele, care pot induce în timp tulburări endocrine şi neuropsihice importante. 2.1.5. Utilizarea de afrodisiace a fost întâlnită pe parcursul întregii istorii a umanităţii, dar nu s-au obţinut produse într-adevăr eficiente şi care să nu posede efecte adverse. Afrodisiacele fac în general parte din clasa euforizantelor şi a vasodilatatoarelor.

2.2 Intoxicaţii accidentale În acest grup se încadrează intoxicaţiile prin contaminarea mediului, intoxicaţiile profesionale, intoxicaţiile medicamentoase, intoxicaţiile alimentare, intoxicaţiile casnice şi intoxicaţiile cu toxine animale sau vegetale. 2.2.1. Intoxicaţiile prin contaminarea mediului (aer, apă, alimente) pot avea caracteristicile unor epidemii atunci când în mediu sunt deversate cantităţi masive de substanţe toxice. Exemple de substanţe care pot produce intoxicaţii prin contaminarea mediului sunt: Ø Oxizii de sulf şi de azot – ajung în atmosferă în urma proceselor de combustie şi sunt foarte iritanţi pentru piele şi mucoase

14 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Ø Tetraetilul de plumb – folosit ca antidetonant în benzina pentru motoarele cu combustie internă Ø Particule de fluoruri – provenite din prelucrarea criolitei în vederea obţinerii aluminiului; pot fi responsabile de producerea maladiei numită fluoroză Ø Hidrocarburile aromatice policiclice – rezultate în urma combustiei materiei organice; au un potenţial cancerigen deosebit Ø Pesticidele – utilizate în agricultură şi gospodării pot să determine intoxicaţii prin contaminarea mediului Substanţele cel mai frecvent implicate în cazurile de contaminare a mediului sunt, în ordine alfabetică, următoarele: cadmiul, dioxidul de carbon, mercurul, oxizii de azot şi oxidanţii fotochimici, oxizii de sulf, plumbul. 2.2.2. Intoxicaţiile profesionale sunt intoxicaţii care survin la locul de muncă, în special în industrie şi în agricultură. Uneori ele se pot produce ca urmare a unor accidente de muncă şi au caracter acut, dar de cele mai multe ori sunt intoxicaţii cronice, insidioase, care rezultă în urma absorbţiei repetate a substanţelor în timpul exercitării profesiei. Substanţele cu care se produce intoxicaţia poartă denumirea de noxe industriale şi pot fi materii prime, intermediari sau produse finite. Principalele grupe sunt: oxidul de carbon, plumbul, arsenul, mercurul, manganul, siliciul, solvenţii, aminele aromatice, pesticidele. Pătrunderea lor în organism se face în special prin inhalare, pe cale cutanată sau eventual prin ingestie. Îmbolnăvirile produse poartă denumirea de boli profesionale, iar nomenclatura lor derivă de la substanţa incriminată (ex. saturnism, hidrargirism). Simptomatologia apare insidios, fără forme caracteristice, iar în momentul în care se instalează boala leziunile sunt bine constituite, astfel încât tratamentul este dificil şi nu poate evita apariţia sechelelor. Prevenirea acestor boli profesionale se bazează pe aplicarea unor măsuri de igienă şi de siguranţă specifice, pe supravegherea medicală a muncitorilor, pe folosirea de echipamente şi materiale de protecţie adecvate şi pe respectarea „concentraţiilor maxime admisibile” în mediul de muncă. 2.2.3. Intoxicaţiile medicamentoase sunt intoxicaţiile care necesită cel mai frecvent îngrijire medicală de specialitate. Ele pot fi: Ø Intoxicaţii voluntare în scop suicidar, care se întâlnesc aproape exclusiv la adult sau la adolescent Ø Intoxicaţii accidentale o La copii sau la bolnavi psihici o Prin erori produse la diferite nivele: medic, farmacist, pacient

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII •

15

Erori ale medicului: - prescrierea unor doze de medicament care depăşesc dozele maxime terapeutice - prescrierea concomitentă a unor formulări care conţin un principiu activ comun sau substanţe cu acţiune sinergică - prescrierea unor medicamente fără a ţine cont de posibilele interacţiuni medicamentoase sau de starea patologică a pacientului care poate modifica farmacocinetica compusului Erori ale farmacistului: - nedescifrarea corectă a prescripţiei - nesemnalarea dozelor maxime depăşite - confuzia de substanţe - eliberarea de preparate neomogene - absenţa consilierii pacientului cu privire la modul de administrare Erori ale pacientului: - supradozarea voluntară - automedicaţia - polipragmazia - confuzia medicamentului - confuzia căii de administrare Aceste intoxicaţii pot fi acute sau cronice. În cazul expunerii cronice, absorbţia repetată poate conduce la fenomene de toleranţă sau ineficacitate, sau la acumularea medicamentului. De aceea, cunoaşterea farmacocineticii compusului are o importanţă deosebită în evitarea acestor intoxicaţii. De asemenea, medicamentele pot induce efecte adverse, uneori grave, iar pentru acelaşi compus sensibilitatea poate varia considerabil de la un individ la altul. Astfel, unii pacienţi pot dezvolta reacţii alergice de gravitate variabilă. Mai trebuie luate în considerare riscurile care apar la subiecţii cu deficienţe de eliminare datorate unor afecţiuni renale sau riscurile posibile la asocierea dintre unele medicamente şi alimente. Importanţa efectelor adverse a determinat dezvoltarea activităţii de farmacovigilenţă, care conform OMS reprezintă: „orice activitate care are drept scop obţinerea de indicaţii sistematice cu privire la legăturile probabile de cauzalitate între medicamente şi reacţiile adverse observate într-o populaţie”. 2.2.4. Intoxicaţiile alimentare pot avea diferite cauze: intoleranţă la anumite alimente, consumarea de alimente care conţin în mod natural substanţe toxice, consumarea de alimente contaminate cu substanţe toxice, consumarea de alimente contaminate microbian.

16 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

1) Intoleranţa la alimente se datorează unei sensibilităţi particulare, de natură alergică, care se observă la anumiţi indivizi atunci când consumă unele alimente cum ar fi crustaceele, unii peşti, căpşuni, etc., care sunt inofensive pentru majoritatea populaţiei. Alergenii sunt reprezentaţi de proteinele alimentare. După primul contact cu organismul, alergenii alimentari determină producerea unor mici cantităţi de imunoglobuline (IgE), care la majoritatea indivizilor este suprimată prin expunerea repetată a mucoasei digestive. Există însă persoane la care producerea de IgE continuă, consecinţa fiind apariţia alergiilor alimentare. Acestea afectează în principal persoanele cu risc genetic crescut, care pot dezvolta şi alte boli genetice. Cantitatea de IgE produsă, deci intensitatea reacţiei alergice, depinde de vârsta la care a avut loc primul contact cu antigenul, de doză, de integritatea mucoasei digestive şi de alţi factori care încă nu au fost identificaţi. 2) Consumarea de alimente care conţin în mod natural substanţe toxice cum ar fi: - ciuperci toxice (Amanita phaloides, Amanita muscaria, etc.) - plante ingerate prin confuzie care conţin alcaloizi toxici (Atropa belladona) sau glicozizi cianogenetici (sâmburi de migdale, piersici, zarzăre) - peşti care în perioade de criză secretă substanţe pentru combaterea prădătorilor - moluşte care acumulează toxine prin ingerarea de plancton toxic 3) Consumarea de alimente contaminate cu substanţe toxice Substanţele pot ajunge în alimente prin: a) cedarea din ambalaje - din conservele vechi necorespunzător cositorite, care pot ceda plumb - din vasele de ceramică artizanală care sunt glazurate cu coloranţi pe bază de plumb, pe care îl pot ceda în alimentele acide - cedarea de plastifianţi sau stabilizanţi din materiale plastice: ex. compuşii organostanici folosiţi ca stabilizanţi pentru materialele din PVC şi care pot fi cedaţi în uleiuri, având proprietăţi hepatotoxice şi neurotoxice; triortocresil fosfatul care a fost folosit ca plastifiant pentru hârtia de ambalaj pentru unt şi care are proprietăţi neurotoxice. b) folosirea de aditivi alimentari, fie neautorizaţi, fie în cantităţi care depăşesc dozele zilnice admisibile - azotaţii, care sunt folosiţi în mezeluri pentru a le păstra culoarea, se pot reduce în anumite condiţii la azotiţi, care în prezenţa aminelor secundare pot forma nitrozamine cancerigene - unii aditivi alimentari sunt alergeni: metabisulfitul de sodiu folosit ca antioxidant poate declanşa crize de astm la unele persoane;

SUBSTANŢE TOXICE ŞI TIPURI DE INTOXICAŢII •

17

- glutamatul de sodiu, care este folosit ca potenţator de gust, este bănuit a fi responsabil de „sindromul restaurantului chinezesc”, caracterizat prin arsuri şi furnicături pe faţă, gât şi partea superioară a corpului. c) remanenţa unor compuşi pe produsele alimentare - pesticide: insecticidele organoclorurate, care sunt stabile, puţin biodegradabile şi cumulative de-a lungul lanţurilor alimentare, au fost în mare parte interzise în marea majoritate a ţărilor; insecticidele organofosforice sunt puţin stabile, suferă o hidroliză rapidă în sol şi pe vegetale, riscul de contaminare a produselor vegetale fiind redus; fungicidele organometalice sunt liposolubile, stabile şi se pot fixa la nivelul SNC, având o toxicitate considerabilă. - substanţe cu care sunt tratate animalele din crescătorii: antibioticele sau estrogenii. Antibioticele sunt folosite pentru a preveni infecţiile sau pentru a creşte calitatea proteinelor animale. Persistenţa lor în alimente poate fi asociată cu unele riscuri: - perturbarea florei intestinale umane; datorită cantităţilor reduse în care se găsesc în alimente, acest risc este redus - declanşarea unor reacţii alergice - inducerea rezistenţei la antibiotice; riscul este redus, datorită concentraţiilor mici în care se găsesc în carne Estrogenii sunt administraţi, în special la bovine, pentru a creşte cantitatea de proteină animală formată. Se pare că metabolismul lor nu este identic cu cel al hormonilor endogeni, putând exista riscuri de natură diferită, motiv pentru care în Europa a fost interzisă utilizarea lor. d) contaminarea cu poluanţi industriali şi radioactivi care se pot acumula în alimentele destinate hranei omului sau animalelor. f) contaminarea alimentelor cu mucegaiuri care produc substanţe toxice numite micotoxine: aflatoxina B1, un hepatocarcinogen foarte puternic, ochratoxinele care sunt nefrotoxice, patulina care este neurotoxică şi care se poate regăsi în unele sucuri de mere. 4) Intoxicaţiile de origine microbiană se datorează consumării de alimente care devin patogene în urma contaminării cu bacterii sau cu toxine bacteriene: a) Intoxicaţiile microbiene survin în urma consumării de alimente contaminate cu toxine bacteriene produse anterior ingerării (ex. toxina botulinică) b) Toxinfecţiile bacteriene se produc în urma consumării de alimente contaminate cu bacterii care se dezvoltă în organismul consumatorului excretând toxine (ex. Escherichia coli, Staphiloccocus, Salmonella).

18 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

2.2.5. Intoxicaţiile casnice sunt în general intoxicaţii acute sau supraacute, care adesea evoluează spre un sfârşit letal sau care în cazul în care sunt tratate pot lăsa sechele grave. În aceste intoxicaţii sunt implicaţi cel mai frecvent copiii şi persoanele în vârstă. Se produc în general din neatenţie, neştiinţă sau imprudenţă. Substanţele incriminate sunt: - substanţele caustice: sodă caustică, acizi tari, unii putând intra în compoziţia unor produse decapante sau detartrante - produse folosite pentru dezinfecţie - coloranţi pentru pielărie sau ţesături - spume izolante sau adezivi pe bază de uree-formol, care pot elibera formaldehidă - pesticide, în special insecticide organofosforice (paration) sau raticide (fosfura de zinc) - medicamente, în special la copii, care confundă drajeurile cu bomboanele - alcool metilic confundat cu alcool etilic 2.2.6. Intoxicaţii cu toxine animale sau vegetale Numeroase plante, insecte, peşti şi reptile conţin toxine (acizi organici, enzime, peptide) care inoculate la mamifere produc durere locală şi o multitudine de efecte sistemice de tip anafilactic, hemolitic, paralizant, cardiotoxic, etc.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ Pentru ca un compus chimic să îşi poată exercita efectul toxic, el trebuie să vină în contact cu sistemul biologic asupra căruia acţionează. Efectul poate să fie local, la nivelul căii de pătrundere, sau sistemic, după absorbţia în organism. După pătrunderea în organism, xenobioticele urmează mai multe faze până la producerea efectului toxic. Acestea sunt: faza de expunere, faza toxicocinetică şi faza toxicodinamică (Fig. 3.1.). Natura şi intensitatea efectelor substanţei toxice vor depinde deci de concentraţia acesteia la nivelul organelor-ţintă, care la rândul său este determinată de: - doza administrată - absorbţie, distribuţie, capacitatea de fixare, excreţia din organism Cu studiul comportării medicamentelor în organism, adică al absorbţiei, distribuţiei, metabolizării şi excreţiei, se ocupă farmacocinetica, care utilizează modele şi ecuaţii matematice pentru a descrie şi apoi a prevedea acest comportament. Toxicocinetica studiază absorbţia, distribuţia, metabolizarea şi excreţia xenobioticelor în condiţii în care se poate produce toxicitate sau în caz de expunere excesivă.

MECANISME DE TRANSPORT PRIN MEMBRANELE BIOLOGICE Organismul este alcătuit din o sumă de organe, ţesuturi, celule şi organite subcelulare, fiecare din acestea fiind protejate de învelişuri specializate sau membrane protectoare. Pentru ca o moleculă de substanţă toxică să fie absorbită, distribuită şi în final excretată din organism după ce şi-a exercitat efectul, ea trebuie să traverseze aceste membrane protectoare (Fig.3.2.). Procesul toxicocinetic implică deci o serie de etape de translocare, care cresc posibilitatea expunerii substanţei exogene la o serie de molecule endogene voluminoase, cum ar fi proteinele, ce pot lega eficient aceste substanţe, modificându-le funcţia şi îndepărtându-le din organism. Xenobioticul poate veni în contact cu diferite părţi ale organismului, putând fi excretat prin rinichi, tractul respirator sau glandele salivare. De asemenea, molecula exogenă poate fi biotransformată de sistemele enzimatice prezente în diferitele organe. Ea poate fi depozitată în organe de depozitare (Fig.3.3.)

20 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Eliberarea substantei Substanta toxica Entitati toxice Interactiunea intre Absorbtie toxice din forma de disponibila pentru Distributie disponibile entitatile toxice si administrare Metabolizare absorbtie receptori Formarea substantei Excretie toxice in tubul digestiv 1 - Faza de expunere

2 - Faza toxicocinetica

3 -Faza toxicodinamica

Fig. 3.1. Parcursul unei substanţe toxice în organism

MEDIUL EXTERN

LICHID EXTRACELULAR MEMBRANA

Mucoasa Respiratorie Pielea

LICHID INTERSTITIAL MEMBRANA- CAPILARA PLASMA MEMBRANA- CAPILARA

LICHID INTERSTITIAL MEMBRANA CELULARA LICHID INTRACELULAR MEMBRANA SUBCELULARA LICHID DIN INTERIORUL ORGANITELOR CELULARE

Fig.3.2. Transportul xenobioticelor prin barierele membranare

Efect toxic

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 21

Diferitele tipuri de membrane au o structură similară. Conform teoriei clasice, membranele sunt alcătuite dintr-un strat bimolecular de fosfolipide, cu grupări polare de fosfatidilcolină sau fosfatidiletanolamină, care predomină pe suprafaţa internă şi pe cea externă a membranei, şi cu lanţuri de acizi graşi, mai mult sau mai puţin perpendiculari, care umplu spaţiul intern. În acest strat dublu sunt inserate proteine, care pot forma pori hidrofili (Fig. 3.4). Acizii graşi din membrană nu au o structură cristalină rigidă, fiind cvasi-fluizi la temperaturi fiziologice. Caracterul fluid al membranelor este determinat în mare parte de structura şi de proporţia acizilor graşi nesaturaţi. Cu cât membranele au un conţinut mai mare de acizi graşi nesaturaţi, cu atât ele sunt mai fluide şi sunt mai uşor străbătute de compuşii chimici. Una din cele mai importante caracteristici ale membranei celulare este permeabilitatea selectivă. Astfel, ea poate fi traversată de anumite substanţe în funcţie de anumite proprietăţi fizico-chimice cum ar fi: mărimea şi forma moleculei, liposolubilitatea, polaritatea, similitudinea structurală cu molecule endogene. EXPUNEREA LA XENOBIOTIC ABSORBTIE

FORMA LIBERA

FORMA LEGATA

DISTRIBUTIE

LOCURI DE DEPOZITARE

LOCURI DE BIOTRANSFORMARE

EXCRETIE

XENOBIOTICUL SI METABOLITII SAI

Fig.3.3. Căile pe care le poate urma un xenobiotic în organism

22 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig.3.4. Structura tridimensională a membranei celulare. Proteinele (a) sunt inserate în stratul bimolecular de fosfolipide (b) (Timbrell J.A., 1991)

Principalele mecanisme prin care xenobioticele pot traversa membranele biologice sunt: difuzia pasivă, filtrarea prin porii membranei, transportul specializat şi endocitoza. 1. Difuzia pasivă reprezintă probabil cel mai important mecanism de transport al xenobioticelor. Constă în trecerea moleculei, fără consum de energie, dintr-un compartiment cu concentraţie mare spre un compartiment cu concentraţie mică, deci în sensul gradientului de concentraţie. Nu prezintă specificitate de substrat şi se bazează pe difuzia substanţei prin stratul lipidic bimolecular. Pentru ca molecula să fie transportată prin difuzie pasivă, trebuie să fie îndeplinite anumite condiţii: - existenţa unui gradient de concentraţie - liposolubilitatea xenobioticului - compusul nu trebuie să fie ionizat Compuşii ionizaţi nu vor difuza uşor prin membrană deoarece pe de o parte ei au o solubilitate redusă în lipide, aceasta fiind esenţială pentru transport, iar pe de altă parte pot determina interacţiuni ionice între xenobiotice, lipidele şi proteinele din membrană.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 23

Aceste condiţii au fost încorporate în teoria pH-partiţiei, conform căreia doar compuşii lipofili neionizaţi vor fi absorbiţi prin difuzie pasivă în situaţia existenţei unui gradient de concentraţie. Multe substanţe chimice de interes toxicologic sunt acizi sau baze slabe, care în soluţie sunt ionizate. Forma ionizată are o liposolubilitate redusă, deci nu va trece uşor prin stratul lipidic al membranei. Forma neionizată are un anumit grad de liposolubilitate, fiind astfel difuzibilă. Viteza de difuzie prin membrană este definită de Legea lui Fick: Viteza de transport = [KS(C2 – C1)] / g Unde: K este coeficientul de difuzie, S este suprafaţa membranei, C2 este concentraţia compusului la suprafaţa externă a membranei, C1 este concentraţia la suprafaţa internă a membranei, iar g reprezintă grosimea membranei. Coeficientul de difuzie prin membrană K depinde de proprietăţile fizicochimice ale compusului, cum ar fi liposolubilitatea, mărimea şi forma moleculei. Parametrul care apreciază liposolubilitatea compuşilor este coeficientul de partiţie lipide / apă, care este cu atât mai mare cu cât compusul este mai lipofil. Pe de altă parte, raportul molar între moleculele ionizate şi cele neionizate ale unui acid sau ale unei baze organice în soluţie depinde de constanta de ionizare, care furnizează o măsură a tăriei acestora. pH-ul la care un acid sau o bază organică slabă este ionizat 50% poartă numele de pKa sau respectiv pKb. Gradul de ionizare al unui compus depinde de pKa-ul său şi de pH-ul soluţiei. Relaţia între pKa şi pH este descrisă de ecuaţiile Henderson-Hasselbach: Pentru acizi:

pKa – pH = log ([forma neionizată] / [forma ionizată])

Pentru baze:

pKa – pH = log ([forma ionizată] / [forma neionizată])

În concluzie, difuzia acizilor slabi prin membrană va fi favorizată de existenţa unui mediu acid, iar cea a bazelor slabe de un mediu bazic (Fig.3.5.).

24 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

pH scazut

BAZE

pH ridicat .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ACIZI

Fig. 3.5. Transportul acizilor şi bazelor slabe în funcţie de pH

2. Filtrarea se bazează pe difuzia substanţei dizolvate în apă prin porii membranei, în sensul gradientului de concentraţie. Fluxul apei prin aceşti pori este determinat de forţele hidrostatice şi / sau osmotice. Procesul este limitat de mărimea porilor membranei. Astfel, porii majorităţii celulelor sunt în jur de 4 nm, permiţând trecerea doar a compuşilor hidrofili, cu masă moleculară de 100-200 daltoni, în timp ce porii membranei glomerulare sunt relativ mari, în jur de 70 nm, permiţând trecerea moleculelor cu masă mai mică decât a albuminei (60 000 daltoni). Deoarece multe substanţe toxice au molecule relativ mari, acest mecanism este mai important în eliminarea xenobioticelor, mai ales pe cale renală. 3. Transportul specializat Există numeroşi compuşi al căror transport prin membrane nu poate fi explicat doar prin difuzie pasivă sau filtrare, deoarece ei sunt fie prea mari pentru a trece prin pori fie sunt prea puţin liposolubili pentru a difuza prin stratul lipidic bimolecular. Totuşi, ei sunt adesea transportaţi rapid prin membrane, chiar împotriva gradientului de concentraţie. Acest fenomen se explică prin existenţa unor sisteme specializate de transportori. Aceste sisteme sunt responsabile de transportul prin membrana celulară a unor substanţe nutritive cum ar fi glucidele, aminoacizii, acizii nucleici, dar şi a unor compuşi exogeni. Transportorul este de obicei o proteină, care leagă substanţa toxică, o trece de o parte pe cealaltă a membranei şi apoi o eliberează, reluându-şi poziţia iniţială şi devenind disponibil pentru un nou ciclu de transport (Fig. 3.6.). Aceste mecanisme sunt importante atunci când xenobioticul prezintă similitudini structurale sau chimice cu compuşi endogeni care utilizează mecanismele de transport specializat în cursul proceselor fiziologice normale. Se cunosc mai multe tipuri de transport specializat:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 25

3.1. Transportul activ, care prezintă următoarele caracteristici: - a) compusul se deplasează împotriva gradientului electrochimic sau de concentraţie - b) se realizează cu consum de energie metabolică - c) poate fi inhibat de substanţele toxice care interferează în metabolismul celular - d) sistemul de transport este saturat la concentraţii mari de substrat - e) sistemul de transport este selectiv pentru anumite caracteristici structurale ale moleculei transportate, deci poate să apară competiţia între diferiţi compuşi pentru legarea de transportor Sistemele de transport sunt cuplate cu enzime ce produc energie (ex. ATPaze) şi deoarece pot fi saturate, procesul se desfăşoară conform unei cinetici de tip Michaelis-Menton. Prin acest mecanism poate fi transportat medicamentul anticanceros 5fluorouracil de către sistemul de transport al pirimidinelor, plumbul poate fi absorbit în intestin prin sistemul de transport al calciului, iar ierbicidul paraquat este preluat în plămâni prin sistemul de transport al poliaminelor. Transportul activ este foarte important mai ales pentru eliminarea xenobioticelor din organism. Sistemul nervos central are două sisteme de transport la nivelul plexurilor coroide, care elimină compuşii din lichidul cefalorahidian, un sistem pentru acizi şi unul pentru bazele organice, rinichiul are două sisteme de transport, iar ficatul cel puţin patru. 3.2. Difuzia facilitată are similitudini cu transportul activ: - a) necesită o moleculă proteică transportoare (enzime numite permeaze) - b) procesul poate fi saturat sau inhibat competitiv dar în acelaşi timp este diferită, deoarece: - c) transportul se realizează în sensul gradientului electrochimic sau de concentraţie - d) procesul nu necesită energie metabolică şi nu este inhibat de substanţele care interferează în metabolismul celular 3.3. Transportul prin intermediul transportorilor ABC Transportorii ABC fac parte din superfamilia proteinelor ABC (ATP Binding Casette) care reprezintă un grup ubicuitar şi evolutiv de proteine cu diferite funcţii, majoritatea legate de transportul prin membranele biologice, în special din celulă spre exteriorul acesteia. Ele sunt alcătuite dintr-un domeniu transmembranar format de obicei din şase helixuri transmembranare şi dintr-un domeniu de legare a nucleotidelor. Cei mai cunoscuţi reprezentanţi ai acestei clase sunt P-glicoproteina şi proteina MRP (multidrug resistance-associated protein) (Fig 3.7).

26 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Membrana

Transportor

Energie Substanta toxica

Fig.3.6. Reprezentarea schematică a transportului activ

Trăsătura cea mai particulară a acestei categorii de transportori este reprezentată de gama foarte largă de substraturi ce pot fi transportate, corelaţia cu structura moleculelor fiind dificil de realizat. Cercetări recente au identificat în molecula substraturilor P-glicoproteinei cel puţin două grupări acceptoare de legături de hidrogen cu o poziţionare spaţială precisă, dar această cerinţă nu pare a fi foarte restrictivă. Compuşii transportaţi nu pot fi foarte hidrofili sau foarte hidrofobi, iar în ceea ce priveşte mărimea moleculei există limite inferioare şi superioare, fiind excluse moleculele foarte mici sau foarte mari. S-a demonstrat că P-glicoproteina este implicată în transportul morfinei din creier înapoi în sânge prin bariera hemato-encefalică şi că poate fi indusă de administrarea cronică a acestei substanţe, ceea ce poate explica parţial mecanismul de instalare a toleranţei la morfină. Proteina MRP poate şi ea transporta substraturi cu structuri foarte variate, dar în special hidrofile, iar interesul său toxicologic deosebit constă în faptul că poate transporta din celulă nu numai molecule amfotere, dar şi metaboliţi conjugaţi cu glutation sau acid glucuronic, participând astfel la aşa numita fază a III a de detoxifiere. Proteina MRP este implicată şi în instalarea rezistenţei la terapia anticanceroasă, prin excluderea din celula ţintă a moleculelor de medicament.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 27

Fig. 3.7. Modelele structurale ale P-glicoproteinei (A) şi Proteinei MRP (B)

4. Endocitoza Acest proces constă în invaginarea membranei celulare pentru a îngloba particule solide (fagocitoza) sau particule lichide (pinocitoza). Se formează o veziculă care poate fuziona cu un lizozom primar, transformându-se în lizozom secundar în care enzimele pot digera macromolecula. Uneori, o porţiune a membranei plasmatice care prezintă receptori specifici leagă macromolecula şi apoi se invaginează. Procesul necesită energie metabolică şi poate fi indus de prezenţa anumitor molecule, cum ar fi ionii din mediul înconjurător. Acest sistem de transport este important la nivelul alveolelor pulmonare, unde particulele insolubile de dioxid de uraniu sau azbest pot fi absorbite prin fagocitoză, sau la nivelul intestinului, pentru absorbţia moleculelor mari. Este de asemenea important pentru eliminarea din sânge a unor substanţe prin intermediul sistemului reticulo-endotelial din splină şi ficat. Din punct de vedere toxicologic, cele mai importante mecanisme de transport prin membrane sunt difuzia pasivă şi transportul activ.

28 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

ABSORBŢIA SUBSTANŢELOR TOXICE Absorbţia reprezintă procesul prin care xenobioticele pătrund în organism, respectiv trec din mediul extern în lichidele biologice (sânge, limfă, lichid cefalorahidian). O substanţă toxică poate pătrunde în organism pe diferite căi, care pot fi clasificate în: - a) căi naturale: o digestivă o respiratorie o cutanată o prin mucoase sau seroase - b) căi artificiale (parenterale) o intraperitoneală (i.p.) o intravenoasă (i.v.) o subcutană (s.c.) o intramusculară (i.m.) Căile principale de absorbţie pentru substanţele toxice sunt calea digestivă, calea respiratorie şi calea cutanată. Căile parenterale se folosesc de obicei pentru administrarea substanţelor medicamentoase şi sunt utilizate în experimentele toxicologice. Calea de pătrundere poate să influenţeze: - efectul toxic final al unui compus; astfel, pH-ul acid stomacal poate determina hidroliza unor substanţe, iar bacteriile intestinale pot modifica natura unor compuşi prin metabolizare, afectând astfel efectul toxic indus - distribuţia ulterioară a substanţelor; astfel, absorbţia cutanată este lentă şi va conduce la o distribuţie iniţială în circulaţia periferică, în timp ce absorbţia pulmonară este rapidă, organele majore fiind expuse foarte repede. - metabolismul prin primul pasaj hepatic; substanţele care sunt absorbite din tractul digestiv trec întâi prin ficat înainte de a ajunge în inimă şi a fi distribuite în întreg organismul, suferind o primă metabolizare sub acţiunea enzimelor hepatice. Substanţele administrate pe alte căi, inclusiv cele absorbite prin mucoasa nazală, bucală sau din rect, nu suferă acest prim pasaj şi ating concentraţii mai mari în organism.

1. Absorbţia digestivă Este o cale de pătrundere majoră pentru substanţele toxice, fie prin intermediul alimentelor contaminate, fie ca medicamente sau substanţe otrăvitoare

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 29

ingerate accidental sau intenţionat. Majoritatea crimelor şi sinuciderilor se produc ca urmare a pătrunderii agentului toxic pe cale orală. Tractul gastrointestinal poate fi privit ca un tub care străbate organismul. Deşi el se găseşte în organism, conţinutul său poate fi considerat ca fiind în afara organismului. De aceea, substanţele toxice din tractul gastrointestinal nu produc afectare sistemică decât după absorbţie, cu excepţia compuşilor iritanţi sau caustici. Absorbţia se poate face de-a lungul întregului tub digestiv, în mod diferenţiat, dependent de: - structura mucoasei digestive - pH-ul de la nivelul segmentului digestiv respectiv Absorbţia se face prin difuzie pasivă, transport activ, endocitoză sau transport paracelular, adică prin joncţiunile intercelulare. Celulele mucoasei intestinale conţin şi P-glicoproteina, care a fost implicată în secreţia intestinală a unor medicamente ca: ciclosporina, digoxinul, unele fluorochinolone, ranitidina, citostatice, beta blocante. Moleculele absorbite sunt transferate în celulele endoteliale, spre capilare şi ficat, sau înapoi spre lumenul intestinal (secreţie). 1.1.

Absorbţia la nivelul cavităţii bucale este o cale minoră de absorbţie a substanţelor toxice deoarece timpul de contact cu mucoasa bucală este foarte scurt. Pot fi absorbite substanţe cum ar fi: alcoolii, aldehidele, cetonele, cianurile, nitroglicerina, hormonii estrogeni, nicotina, cocaina.

1.2.

Absorbţia la nivelul esofagului este foarte redusă, datorită timpului scurt de contact, dar substanţele toxice caustice pot leza grav mucoasa esofagiană.

1.3. Absorbţia la nivelul stomacului depinde de: - Coeficientul de partiţie al substanţei: substanţele liposolubile sunt mai uşor absorbite prin difuzie pasivă, care reprezintă procesul de absorbţie cel mai important din punct de vedere cantitativ, dar în acelaşi timp, un anumit grad de hidrosolubilitate, care favorizează dizolvarea în conţinutul apos al stomacului şi deci un contact intim cu mucoasa, creşte gradul de absorbţie; cel mai bine se vor absorbi substanţele cu un coeficient de absorbţie apropiat de 1. - Prezenţa formei neionizate, absorbabile prin difuzie pasivă. Absorbţia va fi deci determinată de pH-ul mediului şi de pKa-ul substanţei toxice. Deoarece pH-ul secreţiei gastrice este acid, cuprins între 1,2 şi 3,5, în funcţie de starea de plenitudine a stomacului (1,2-1,8 a jeun şi 3-3,5 după masă), la acest nivel se vor absorbi acizii slabi (pKa > 2,5), care se găsesc în forma neionizată. Bazele slabe care sunt ionizate sau parţial ionizate (pKa < 2,5) sunt neabsorbabile sau greu absorbabile. Aceste diferenţe sunt amplificate de

30 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

faptul că la pH-ul sângelui circulant de 7,4 acizii slabi se găsesc sub formă ionizată şi vor fi preluaţi de fluxul sanguin, în timp ce bazele slabe sunt neionizate şi vor avea tendinţa de a difuza înapoi în stomac. 1.4.

Absorbţia la nivelul intestinului subţire interesează majoritatea compuşilor care pătrund pe cale orală. - Bazele slabe, care la pH-ul mai alcalin (pH 6) al sucului intestinal se găsesc sub formă neionizată, vor fi rapid absorbite, deşi pH-ul 7,4 al plasmei nu favorizează îndepărtarea lor, fiind posibilă reîntoarcerea în intestin. - Acizii slabi, care se găsesc sub formă ionizată, vor fi totuşi absorbiţi datorită: o Suprafeţei mari a intestinului subţire şi timpului lung de sejur în acest segment al tractului digestiv o Ionizării moleculei la pH-ul 7,4 al sângelui, care favorizează îndepărtarea de la locul absorbţiei şi menţinerea gradientului de concentraţie de-a lungul membranei intestinale (Fig.3.8.). o Existenţei unui microstrat acid în vecinătatea mucoasei intestinale, cu grosime de 20 µm şi al cărui pH este cu 0,5 unităţi mai mic decât cel din lumenul intestinal; aciditatea acestui microstrat este mai pronunţată în duoden faţă de porţiunea distală a intestinului subţire. Plasma pH 7,4

+

NH3

NH2

Stomac pH 2

-

COO

+

NH3

COOH

NH2

Intestin pH 8-9 COOH

COOH

-

COO

Plasma pH 7,4 -

COO

NH2 +

NH3

Fig. 3.8. Absorbţia moleculelor ionizate la nivelul stomacului şi intestinului

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 31

Absorbţia substanţelor toxice din intestin este favorizată de (Fig.3.9): Ø Grosimea redusă a mucoasei intestinale unistratificate Ø Suprafaţa considerabilă de contact oferită de prezenţa vilozităţilor şi a microvilozităţilor Ø Vascularizaţia bogată la acest nivel Ø Timpul lung de contact dintre mucoasă şi substanţă Ø pH-ul apropiat de cel fiziologic Ø Conţinutul de substanţe emulgatoare. Aceste substanţe emulgatoare sunt reprezentate de sărurile biliare, săruri de sodiu şi potasiu ale acizilor biliari conjugaţi cu glicină şi taurină. Ele au un rol important în absorbţie, îmbunătăţind viteza de dizolvare şi solubilitatea în apă a substanţelor insolubile. Alţi factori care influenţează absorbţia sunt: mărimea particulelor, prezenţa unor solvenţi şi emulgatori, prezenţa microorganismelor, legarea de componente ale conţinutului gastric, viteza de golire a stomacului, temperatura conţinutului stomacal, motilitatea intestinală, efectul alimentelor, secreţia gastrointestinală.

Fig. 3.9. Tractul intestinal la om (a: ficatul; b: stomacul; c: duodenul; d: ileonul; e: colonul; f: secţiune longitudinală prin ileon; g: vilozitate; k: detaliu al unei vilozităţi; o: detaliu al celulelor epiteliale cu microvilozităţi (Timbrell J.A, 1991)

32 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Un aspect important al absorbţiei gastrointestinale este reprezentat de circuitul enterohepatic. După secreţia prin bilă a metaboliţilor conjugaţi hidrosolubili, aceştia pot fi hidrolizaţi în intestin de microflora intestinală sau de alte condiţii locale, eliberând compusul într-o formă mai puţin polară, care poate fi reabsorbită şi ajunge din nou în ficat prin vena portă (Fig.3.10). Acest proces se poate repeta de mai multe ori şi creşte timpul de înjumătăţire biologică, făcând posibilă apariţia unor efecte adverse la nivel hepatic. Un alt ciclu este circuitul buco-enteric, în care substanţele toxice absorbite în intestin sunt transportate de sânge ajungând la nivelul glandelor salivare, fiind apoi excretate în cavitatea bucală. Un exemplu de substanţă toxică ce poate intra în acest circuit este mercurul.

Fig. 3.10. Diagrama circulaţiei enterohepatice (Niesink R.J.M., et al, 1996)

1.5. Absorbţia la nivelul intestinului gros Capacitatea de absorbţie a intestinului gros este mult mai redusă faţă de cea a intestinului subţire, iar această cale de pătrundere este mai puţin importantă pentru substanţele toxice. Absorbţia în acest caz depinde de : - a) locul de administrare, absorbţia fiind mai rapidă şi mai eficientă atunci când substanţa este aplicată în apropierea anusului, zonă irigată de venele hemoroidale inferioare, care evită pasajul hepatic; - b) vârstă, procesul descrescând treptat o dată cu înaintarea în vârstă.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 33

În concluzie, absorbţia gastrointestinală se realizează preponderent la nivelul intestinului subţire, fapt corelat pozitiv cu suprafaţa disponibilă pentru absorbţie a acestui segment digestiv (Tabel III.1).

Tabel III.1. Mărimea suprafeţei de absorbţie pentru diferitele segmente ale tractului digestiv Cavitatea bucală Stomac Intestinul subţire Intestinul gros Rect

0,02 0,1-0,2 100 0,5-1,0 0,04-0,07

2. Absorbţia pe cale respiratorie Este o cale de absorbţie importantă pentru pătrunderea substanţelor toxice care se găsesc în aerul din mediul industrial sau comunal sub formă de gaze, vapori ai lichidelor volatile sau particule fine, lichide sau solide. Sistemul respirator este prevăzut cu unele mecanisme de protecţie împotriva substanţelor toxice, în special a celor sub formă de particule. Totuşi, el este vulnerabil din mai multe motive: - Schimbul de gaze la nivelul alveolelor capilare se produce la o distanţă foarte mică (1-2 µm) de sistemul circulator, ceea ce permite nu numai schimbul de oxigen şi dioxid de carbon, ci şi schimbul de substanţe toxice gazoase. - Pereţii alveolari sunt umectaţi de un film apos subţire, care facilitează absorbţia iniţială a substanţelor toxice din aerul alveolar. Totuşi, în unele cazuri, componenta fosfolipidică de la suprafaţa stratului monomolecular interacţioneză cu compuşii cu liposolubilitate mare şi le întârzie absorbţia. - Suprafaţa alveolelor pulmonare este foarte mare (între 50 şi 100 de m2), de aproximativ 50 de ori mai mare decât suprafaţa pielii (Fig. 3.11.).

34 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig. 3.11. Structura sistemului respirator (a: traheea; b: bronhiolă; c: sac alveolar cu vascularizaţia aferentă; d: aranjarea vaselor de sânge în jurul alveolelor; e: aranjarea celulelor şi a spaţiilor de aer în alveole; f: structura celulară a alveolei; g: celulă endotelială a vasului capilar; h: eritrocite; i: celulă epitelială a sacului alveolar. (Timbrell J.A., 1991)

Procesul respiraţiei implică trecerea aerului prin mai multe segmente intercorelate care includ: nasul, gura, faringele, traheea, bronhiile şi apoi căile respiratorii inferioare şi alveolele pulmonare. Cantitatea de aer reţinută în plămân este cunoscută drept volumul rezidual. Viteza de pătrundere a substanţelor toxice sub formă de vapori este controlată de viteza de ventilaţie alveolară, compusul fiind prezent în alveole de manieră temporară, de aproximativ 20 de ori / minut. În cazul inhalării gazelor, moleculele acestora difuzează din spaţiul alveolar în sânge, în care se dizolvă. Cu excepţia unor gaze cu afinitate specială pentru anumite structuri ale organismului (ex. legarea monoxidului de carbon de hemoglobină), captarea unui gaz de un ţesut se realizează de obicei printr-un simplu proces fizic de dizolvare. Dizolvarea moleculelor de gaz în sânge are loc până la stabilirea unui echilibru între moleculele de gaz din sânge şi cele din spaţiul alveolar, echilibru la care raportul concentraţiilor în cele două faze este constant şi poartă denumirea de coeficient de partiţie sânge-gaz, fiind caracteristic pentru fiecare substanţă. Viteza de absorbţia a gazelor la nivel pulmonar va depinde deci de valoarea acestui coeficient:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 35

- pentru gazele cu solubilitate redusă, viteza de absorbţie depinde în principal de fluxul sanguin în plămâni - pentru gazele cu solubilitate mare, viteza de absorbţie depinde în principal de ventilaţie (frecvenţa respiratorie). În cazul particulelor solide, absorbţia depinde în principal de mărimea acestora (Fig. 3.12).

Nas Gura Faringe 5 - 30µm Trahee Bronhii Bronhiole 1 - 5µm

Alveole 1 µm

Fig. 3.12. Segmentele la nivelul cărora se produce absorbţia în tractul respirator

Particulele cu dimensiuni mai mari de 5 µm sunt de obicei depozitate în regiunea naso-faringelui. Particulele între 2 şi 5 µm sunt depozitate în principal în zona traheobronşică, de unde sunt eliminate prin mişcarea retrogradă a stratului de mucus din porţiunea ciliată a tractului respirator. Tusea şi strănutul favorizează deplasarea mucusului şi a particulelor spre cavitatea bucală, de unde particulele pot fi eventual înghiţite şi absorbite în tractul gastrointestinal. Particulele de 1 µm sau mai mici pătrund în sacii alveolari. Ele pot fi absorbite în circulaţia generală sau pot fi fagocitate de macrofagele alveolare şi ajung în limfă, unde substanţele toxice pot fi depozitate perioade lungi de timp. Îndepărtarea particulelor din plămâni se realizează în mare măsură prin dizolvare şi transport vascular. Unele particule pot însă rămâne în alveole un timp nedefinit. Aceasta are loc atunci când celulele alveolare proliferează în loc să se descuameze şi înglobează particule de praf, care în asociere cu dezvoltarea unei reţele de fibre de reticulină conduc la formarea unei

36 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

plăci sau a unui nodul. De exemplu, fibrele de azbest sunt fagocitate, rămân în plămân şi pot cauza fibroză şi chiar tumori pulmonare.

3. Absorbţia cutanată Pielea este un ţesut multistratificat complex, care constituie o barieră fiziologică relativ eficientă împotriva pătrunderii xenobioticelor. Ea este relativ impermeabilă faţă de majoritatea ionilor şi faţă de soluţiile apoase, dar este permeabilă pentru multe substanţe toxice în stare de agregare solidă, lichidă sau gazoasă. Pielea este alcătuită din trei straturi: epidermă, derm şi hipoderm, în acesta din urmă găsindu-se aparatul pilosebaceu şi glandele sudoripare (Fig.3.13).

Fig. 3.13. Structura pielii la mamifere

(Niesink R.J.M., et al, 1996)

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 37

Absorbţia substanţelor toxice se poate face prin: Ø foliculii piloşi, sau celulele glandelor sebacee şi sudoripare; este o cale minoră, deoarece suprafaţa lor raportat la suprafaţa totală a pielii este doar de 0,1-1%. Ø Difuzie prin celulele epidermei care constituie porţiunea majoritară a suprafeţei pielii. Epiderma este un ţesut de grosime diferită (între 0,1 şi 0,8 mm), alcătuit din mai multe straturi. Stratul extern, care reprezintă bariera principală în calea pătrunderii substanţelor exogene, este stratul cornos, care este constituit din 8-16 straturi de celule aplatizate, cheratinizate. Aceste celule moarte, cheratinizate, sunt foarte hidrofile, proprietate care menţine pielea moale şi suplă. Pielea este acoperită de un ulei natural, sebumul, care conferă epidermei capacitatea de a împiedica pătrunderea apei. Stratul cornos uman prezintă diferenţe fizico-chimice şi structurale de la o regiune a organismului la alta, care influenţează gradul de absorbţie; de exemplu, substanţele toxice se absorb uşor prin scrot, cap, gât, axilă, mai puţin prin peretele abdominal şi foarte greu în regiunea plantară sau palmară. • Prima etapă a absorbţiei prin piele este difuzia xenobioticelor prin epidermă, care este o etapă limitantă de viteză datorită prezenţei stratului cornos: - substanţele polare difuzează prin suprafaţa externă a filamentelor proteice ale stratului cornos hidratat - moleculele nepolare se dizolvă şi difuzează prin matricea lipidică dintre filamentele proteice, viteza de difuzie fiind direct proporţională cu liposolubilitatea şi invers proporţională cu masa moleculară; totuşi, substanţele foarte hidrofile sau foarte lipofile nu pot străbate stratul cornos. • A doua etapă a absorbţiei constă în difuzia substanţei toxice prin derm, care reprezintă un mediu de difuzie poros, neselectiv şi apos. Din derm, compuşii sunt preluaţi în circulaţia sistemică prin numeroasele capilare venoase şi limfatice care îl irigă. Absorbţia cutanată poate fi influenţată de: - proprietăţile fizico-chimice ale substanţei, în special gradul de ionizare, mărimea moleculei, solubilitatea în apă şi lipide - pH-ul pielii - temperatura ambiantă - masajul local - aplicarea de surfactanţi şi săpunuri - solventul în care este condiţionată substanţa Prin tegumente vor pătrunde: - substanţe gazoase şi volatile: H2S, CO, CO2, HCN - compuşi organici lipofili: hidrocarburi alifatice şi aromatice, alcooli, solvenţi cloruraţi, nitro- şi aminoderivaţi aromatici, fenoli, insecticide organofosforice, alcaloizi lichizi (nicotina)

38 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

- unele substanţe minerale (Hg, Pb, Bi, ioduri alcaline), direct sau după reacţie cu acizii graşi din sebum.

4. Absorbţia pe cale parenterală Această cale de administrare se întâlneşte de obicei în intoxicaţiile acute medicamentoase, în tentativele de sinucidere şi în cazurile de supradozare la toxicomani. Viteza de absorbţie depinde de modul de administrare, fiind cea mai mare în cazul administrării intravenoase, când substanţa toxică este introdusă direct în circulaţia sanguină, eliminându-se procesul de absorbţie. Calea intraperitoneală este utilizată în experimentele toxicologice, atunci când se urmăreşte asigurarea unei biodisponibilităţi cât mai apropiată de 100% a unei substanţe insolubile. Absorbţia xenobioticelor este rapidă, datorită vascularizaţiei bogate şi a suprafeţei mari a cavităţii peritoneale. Compuşii sunt absorbiţi iniţial în circulaţia portală şi deci vor trece prin ficat înainte de a ajunge la organe. Căile subcutanată şi intramusculară se caracterizează prin viteze de absorbţie mai reduse, dar xenobioticul ajunge direct în circulaţia generală. Viteza de absorbţie poate fi influenţată de modificarea circulaţiei sanguine în zona respectivă, de exemplu prin asocierea unui vasoconstrictor cum ar fi adrenalina, care reduce viteza de resorbţie şi prelungeşte acţiunea substanţei toxice.

DISTRIBUŢIA SUBSTANŢELOR TOXICE Distribuţia este procesul de transfer al substanţei chimice din circulaţia generală în ţesuturile organismului. Procesul poate fi caracterizat atât sub aspectul vitezei cât şi al extinderii, parametrii farmacocinetici corespunzători fiind constanta vitezei de distribuţie (α, k12, k21) şi volumul aparent de distribuţie (Vd). Distribuţia are loc de obicei rapid. Viteza de distribuţie este determinată întro primă fază de circulaţia sanguină şi de viteza de difuzie din capilare în celulele unui anumit organ sau ţesut. Distribuţia finală depinde în mare măsură de afinitatea xenobioticului pentru diferite ţesuturi. Pătrunderea substanţei toxice în celule se face prin difuzie pasivă sau transport activ. Moleculele mici hidrosolubile şi ionii difuzează prin porii membranei celulare, în timp ce moleculele liposolubile difuzează prin membrană. Moleculele foarte polare şi ionii de dimensiuni medii sau mari nu pot pătrunde decât prin mecanisme specializate de transport. Lichidele organismului sunt divizate în trei compartimente distincte: apa plasmatică, apa interstiţială şi apa intracelulară. Apa extracelulară este constituită

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 39

din apa plasmatică şi apa interstiţială. La om, plasma reprezintă aproximativ 4% din greutatea corporală, dar 53% din volumul sanguin total, lichidul interstiţial constituie 13% din greutatea corporală, iar lichidul intracelular 41%. Concentraţia substanţei toxice în sânge după expunere depinde de volumul aparent de distribuţie. Astfel, dacă substanţa este distribuită doar în plasmă, în compartimentul vascular va fi atinsă o concentraţie mare. Dacă însă aceeaşi cantitate de xenobiotic este distribuită în apa interstiţială şi intracelulară, concentraţia în compartimentul vascular va fi mult mai mică. Distribuţia substanţelor toxice este însă complexă şi nu poate fi apreciată doar prin distribuţia în unul din compartimentele apoase ale organismului. Legarea de şi/sau dizolvarea în depozite de stocare cum ar fi ţesutul adipos, ficatul sau oasele, sunt factori importanţi în determinarea distribuţiei unui xenobiotic. Substanţele toxice sunt transportate în organism de către sânge fie dizolvate în apa plasmatică, fie legate de un transportor. Acest transportor poate fi reprezentat de: - proteinele plasmatice, în special albuminele, care leagă ioni şi molecule în general mici - lipoproteinele, care leagă moleculele liposolubile, probabil prin dizolvare în componenta lipidică - eritrocitele, care pot fixa unii compuşi cum ar fi plumbul - leucocitele, care pot fagocita particulele insolubile Distribuţia xenobioticelor în organism depinde de: Ø legarea de proteinele plasmatice Ø afinitatea pentru proteinele tisulare Ø debitul sanguin în organ Ø existenţa unor „bariere” de protecţie 1. Legarea de proteinele plasmatice se face în principal de albumină şi eventual de alfa-1-glicoproteina acidă sau de globulină. Această legare face ca substanţa toxică să nu fie disponibilă imediat pentru a fi transferată în spaţiul extravascular, deci proteinele plasmatice exercită atât un rol de transport cât şi de stocare. Legăturile formate sunt însă reversibile (legături ionice, de hidrogen, forţe van der Waals, interacţiuni hidrofobe) şi substanţa toxică poate fi eliberată pentru a traversa peretele vascular. Disocierea se poate produce atunci când afinitatea xenobioticului pentru o altă moleculă sau component celular este mai mare decât cea pentru proteinele plasmatice, sau când scade concentraţia compusului nelegat. Astfel, de câte ori concentraţia dintr-un compartiment, sânge sau ţesut, scade, are loc o redistribuţie. Între diferitele substanţe se poate produce o competiţie pentru legarea de proteinele plasmatice, fapt care este la originea a numeroase interacţiuni medicamentoase, unele cu potenţial toxic considerabil (de exemplu interacţiunea sulfamidelor

40 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

antibacteriene cu sulfamidele antidiabetice, care poate provoca apariţia comei hipoglicemice). 2. Afinitatea pentru proteinele tisulare conduce la fixarea preferenţială a substanţelor toxice în anumite organe. 3. Debitul sanguin în organ reprezintă unul din principalii factori care determină distribuţia diferitelor xenobiotice în organe. Astfel, organele puternic vascularizate (ficat, rinichi) pot concentra substanţele toxice preferenţial faţă de alte organe. Creierul, care reprezintă doar 2% din greutatea corporală, primeşte 16% din fluxul cardiac şi poate deci reţine cantităţi mai mari de xenobiotice. 4. „Barierele” organismului Bariera hemato-encefalică protejează sistemul nervos central de fluctuaţiile compoziţiei sângelui, realizând o separare aproape completă a acestuia de restul organismului. Bariera hemato-encefalică (BHE) este localizată la nivelul peretelui capilar, unde celulele endoteliale sunt strâns unite, lăsând între ele un spaţiu extrem de redus, care nu permite trecerea substanţelor toxice legate de proteinele sanguine spre creier. Se estimează că suprafaţa capilarelor cerebrale este de aproape 20 m2 pentru o greutate medie a creierului uman de 1300 g. Comparativ cu celulele endoteliale ale altor capilare, capilarele cerebrale au un număr redus de vacuole şi un procent crescut al fracţiunii mitocondriale, ceea ce face ca principalul sediu anatomic şi funcţional al BHE să fie endoteliul cerebral. Datorită existenţei barierei hemato-encefalice, schimbul direct între compartimentul vascular şi parenchimul cerebral este semnificativ redus. Pot pătrunde gazele şi moleculele lipofile de dimensiuni mici, dar pentru majoritatea celorlalte substanţe transportul se face prin intermediul unor transportori sau a veziculelor. Sunt patru motive pentru care substanţele toxice nu pot pătrunde uşor în creier: - celulele endoteliului capilar din SNC sunt strâns lipite, lăsând foarte puţini pori între ele, astfel încât împiedică trecerea moleculelor hidrosolubile de dimensiuni mici până la medii - conţin un transportor dependent de ATP, proteina MDR, care transportă unele substanţe înapoi în sânge - capilarele din SNC sunt înconjurate în mare măsură de astrocite, care trebuie să fie traversate de compuşii liposolubili - concentraţia în proteine a lichidului interstiţial din SNC este mai scăzută comparativ cu alte lichide biologice, ceea ce limitează deplasarea compuşilor insolubili în apă prin transport paracelular.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 41

Pătrunderea substanţelor toxice în creier este deci condiţionată de liposolubilitatea acestora şi de prezenţa formei neionizate. Unele xenobiotice pătrund în creier printr-un proces ce implică transportori. De exemplu, metilmercurul se combină cu cisteina, formând o structură asemănătoare cu metionina, care este acceptată de transportorul aminoacizilor din celulele endoteliului capilar. Bariera placentară este un organ intermediar între făt şi peretele uterului, prin care se realizează transferul de gaze, substanţe nutritive şi produşi de degradare între sângele mamei şi al copilului. Ea este alcătuită din mai multe straturi de celule, care variază de la o specie la alta. Placenta are şi un oarecare rol de protejare a fătului faţă de pătrunderea substanţelor toxice datorită capacităţii sale de a biotransforma unele xenobiotice, dar poate fi străbătută prin difuzie pasivă de substanţele liposolubile. Concentraţia compusului atinge de obicei 75-100% din concentraţia în sângele matern în 5 minute de la administrare, de aceea protecţia oferită fătului de această barieră este redusă.

STOCAREA SUBSTANŢELOR TOXICE Sângele distribuie substanţele toxice în toate ţesuturile organismului care, în funcţie de afinitatea lor, pot reţine cantităţi mai mari sau mai mici de substanţă. Această reţinere poate fi de două tipuri: - a) în ţesuturi care reprezintă locul de acţiune al substanţei toxice, caz în care se foloseşte termenul de localizare. Un astfel de exemplu este monoxidul de carbon, care are afinitate foarte mare pentru hemoglobină, sau paraquatul, care se acumulează în plămân. - b) în alte ţesuturi decât cele la nivelul cărora îşi manifestă acţiunea toxică, când se preferă termenul de stocare sau cel de acumulare. De exemplu, plumbul este stocat în oase, dar îşi manifestă acţiunea la nivelul ţesuturilor moi, insecticidele organoclorurate se acumulează în ţesutul adipos, dar acţionează toxic la nivelul sistemului nervos central. Substanţa toxică din organele de stocare este în echilibru cu fracţiunea liberă din plasmă. Deci, pe măsură ce compusul este biotransformat sau excretat din organism, o altă fracţiune este eliberată din depozite, fapt care poate creşte foarte mult timpul de înjumătăţire biologică. Locurile majore de stocare a substanţelor toxice în organism 1. Proteinele plasmatice pot fixa atât constituenţi fiziologici normali, cât şi xenobiotice. Majoritatea acestora se leagă de albumine. Transferina, o beta1

42 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

globulină, este implicată în transportul fierului în organism, iar ceruloplasmina în transportul cuprului. Alfa- şi beta-lipoproteinele leagă compuşi liposolubili cum ar fi vitaminele, colesterolul, hormonii steroizi, dar şi xenobiotice. Substanţele cu caracter bazic se pot lega de alfa1-glicoproteina acidă. Legarea de proteinele plasmatice este reversibilă, dar unii compuşi se pot lega atât de puternic încât după o singură doză rămân în organism mai mulţi ani. De exemplu, medicamentul Teridax (acidul 2,4,6-triiodo-3-hidroxifenil propionic) are din acest motiv un timp de înjumătăţire de 2,5 ani. 2. Proteinele tisulare din ficat şi rinichi Ficatul şi rinichiul au o mare capacitate de a lega diferite substanţe chimice şi concentrează probabil mai multe xenobiotice decât toate celelalte organe împreună. Deşi mecanismele prin care ficatul şi rinichiul reţin substanţele toxice din sânge nu au fost pe deplin elucidate, se pare că în majoritatea cazurilor sunt implicate transportul activ şi legarea de unii componenţi tisulari. Ø Astfel, a fost identificată în citoplasma hepatocitelor o proteină, ligandina, care are o mare afinitate pentru acizii organici, şi care leagă şi azocoloranţii carcinogeni şi corticosteroizii. Ø Metalotioneina, o proteină cu sulf cu masă moleculară mică din ficat şi rinichi, are o mare afinitate pentru metale cum ar fi cadmiul şi zincul. 3. Ţesutul adipos este un loc important de stocare pentru compuşii cu liposolubilitate mare cum ar fi: insecticidele organoclorurate, nitroderivaţii aromatici, solvenţii organici. Se pare că reţinerea se face prin simplă dizolvare a substanţei toxice în grăsimile neutre. Această stocare determină scăderea concentraţiei xenobioticului la locul de acţiune, deci este de aşteptat ca astfel de compuşi să aibă o toxicitate mai redusă la persoanele obeze decât la cele normale. Concentraţia plasmatică poate creşte însă mult ca urmare a mobilizării rapide a lipidelor după o perioadă de post, existând posibilitatea apariţiei de intoxicaţii acute. 4. Ţesutul osos reprezintă locul major de stocare pentru unele substanţe toxice cum ar fi fluorul, plumbul, stronţiul. Fixarea are loc în urma unei reacţii rapide de schimb între substanţa toxică din lichidul interstiţial şi cristalele de hidroxiapatită din os. Datorită similitudinii ca dimensiune şi sarcină, ionul fluorură poate înlocui ionul hidroxil, în timp ce ionul de calciu poate fi înlocuit de ionii de plumb sau stronţiu. Stocarea substanţelor toxice în os poate sau nu să aibă consecinţe nedorite. De exemplu, plumbul nu este toxic pentru os, în timp ce fluorul produce fluoroză scheletică, iar stronţiul radioactiv osteosarcom. Xenobioticele stocate în os pot fi eliberate prin:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 43

- schimb ionic la nivelul suprafeţei cristalelor de hidroxiapatită - dizolvarea cristalelor prin mecanisme osteoclastice Unii compuşi mai pot fi stocaţi în fanere (arsen, seleniu), piele (aur, argint), sau în celulele sistemului reticulo-endotelial care pot fagocita particulele.

ELIMINAREA SUBSTANŢELOR TOXICE După absorbţie în organism, distribuţie şi biotransformare, substanţele toxice sunt eliminate, fie ca atare, fie sub formă de metaboliţi. Eliminarea include toate procesele care conduc la scăderea concentraţiei xenobioticului în organism. Aceasta se poate realiza prin metabolizare, sau prin excreţie. Excreţia la rândul ei se poate face pe cale renală, prin fecale, pe cale pulmonară sau prin secreţii ale organismului: sudoare, salivă, lacrimi sau lapte. Eliminarea începe imediat după pătrunderea xenobioticului în organism, dar poate să nu reprezinte procesul major până în momentul în care absorbţia şi distribuţia sunt diminuate. Factorii care influenţează eliminarea sunt: - integritatea funcţională a principalelor sisteme de organe (cardiovascular, renal, hepatic) - vârsta - sexul - competiţia pentru procesul de eliminare sau inhibarea acestuia de către alte xenobiotice - saturarea proceselor enzimatice - factorii genetici - proprietăţile fizico-chimice ale substanţei

1. Excreţia renală Rinichii reprezintă principalele organe excretoare. Pe această cale se elimină majoritatea produşilor rezultaţi din căile metabolice normale, dar şi xenobioticele polare şi metaboliţii hidrofili ai xenobioticelor lipofile. Unitatea funcţională a rinichiului este nefronul (Fig. 3.14.), la nivelul acestuia având loc procesele fiziologice ce sunt utilizate atât pentru excreţia substanţelor endogene, cât şi a celor exogene, şi anume: filtrarea glomerulară, secreţia tubulară şi reabsorbţia tubulară.

44 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig. 3.14. Structura nefronului (McKimm W., 2000)

1.1.

1.2.

Filtrarea glomerulară reprezintă mecanismul principal de eliminare. La adult, prin artera renală trece aproximativ 25% din volumul minut cardiac (1,2-1,3 l/minut), deci în medie 1800 l de sânge pe zi. Sângele suferă un proces de filtrare cu o viteză de 130 ml/minut (190 l/zi), care constituie urina primară. Deoarece capilarele glomerulilor au pori mari (70 nm), majoritatea substanţelor toxice pot fi filtrate la acest nivel, cu excepţia moleculelor de dimensiune mare, cu masa moleculară mai mare de 60000 daltoni, sau a celor legate de proteinele plasmatice. Reabsorbţia tubulară este cel de-al doilea proces major care are loc în rinichi. Filtratul glomerular conţine apă şi substanţe care sunt necesare organismului: aminoacizi, glucoză, săruri, care trebuie recuperate din filtrat în timpul procesului de eliminare. Acest proces are loc în special la nivelul porţiunii proximale a tubilor renali, prin mecanisme de difuzie pasivă sau transport activ. Apa şi majoritatea ionilor sunt reabsorbiţi în tubul distal şi tubul colector. Reabsorbţia xenobioticelor are loc o dată cu absorbţia moleculelor endogene şi se face de obicei prin difuzie pasivă. Substanţele liposolubile sunt reabsorbite eficient, în timp ce compuşii polari şi ionii sunt excretaţi în urină. De aceea,

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 45

pentru substanţele toxice cu caracter slab acid sau slab bazic eliminarea renală poate fi favorizată prin modificarea pH-ului urinar; astfel, alcalinizarea urinei conduce la ionizarea acizilor slabi, ceea ce împiedică reabsorbţia tubulară, crescând eliminarea. 1.3. Secreţia tubulară a substanţelor toxice se poate face prin difuzie pasivă sau printr-un mecanism activ. Difuzia pasivă are o semnificaţie minoră deoarece filtrarea glomerulară, fiind mult mai rapidă, va contribui la crearea unui gradient de concentraţie care este favorabil reabsorbţiei tubulare. Secreţia activă se realizează cu ajutorul a două sisteme de transport, unul pentru acizi (anioni) şi altul pentru baze (cationi). Aceste sisteme au specificitate redusă, astfel încât un număr mare de compuşi pot fi transportaţi activ în tubii renali. Sistemul anionic poate transporta acizi organici (acid acetilsalicilic, peniciline), acizi sulfonici şi metaboliţi acizi (sulfoconjugaţi, glucuronoconjugaţi, conjugaţi cu glicina). Sistemul cationic poate transporta baze organice (morfină, histamină) şi compuşi cuaternari de amoniu. Deoarece specificitatea sistemelor de transport este redusă, diferite xenobiotice pot intra în competiţie pentru transportor. De asemenea, afinitatea sistemelor de transport activ pentru diverşi compuşi fiind mai mare decât afinitatea proteinelor plasmatice, legarea de proteine nu reprezintă un factor limitant al excreţiei. Gradul de eliminare a unei substanţe toxice poate fi apreciat prin clearanceul renal, care reprezintă cantitatea de sânge sau plasmă epurată total de xenobiotic în unitatea de timp: Cl = [Cu x V] / Cp Unde Cu este concentraţia substanţei în urină Cp este concentraţia substanţei în plasmă V este debitul urinar (ml / min).

2. Excreţia prin fecale Este un proces care nu este la fel de bine cunoscut ca şi excreţia pe cale renală. Sursele care contribuie la excreţia substanţelor toxice prin fecale sunt: 2.1. Substanţele neabsorbite în tractul gastrointestinal: macromolecule şi compuşi complet ionizaţi cu masă moleculară mare, cum ar fi polimerii sau bazele cuaternare de amoniu 2.2. Excreţia biliară: reprezintă probabil sursa cea mai importantă a xenobioticelor eliminate prin fecale şi a doua cale de eliminare după cea renală. Ficatul are o poziţie foarte avantajoasă pentru îndepărtarea substanţelor toxice

46 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

ajunse în sânge după absorbţia din tractul gastrointestinal, deoarece acest sânge va trece prin ficat înainte de a ajunge în circulaţia generală. Astfel, ficatul poate reţine aceşti compuşi, împiedicând distribuţia lor în alte segmente ale organismului. În plus, ficatul este sediul major al biotransformării xenobioticelor, iar metaboliţii formaţi pot fi excretaţi direct în bilă. Compuşii exogeni excretaţi prin bilă pot fi împărţiţi în trei clase în funcţie de raportul între concentraţiile lor în bilă şi în plasmă: - Substanţele din clasa A (raportul în jur de 1) – sodiul, potasiul, glucoza, mercurul, taliul, cesiul, cobaltul - Substanţele din clasa B (raportul mai mare de 1, de obicei între 10 şi 1000) – acizii biliari, bilirubina, plumbul, arsenul, manganul şi multe alte xenobiotice - Substanţele din clasa C (raportul este subunitar) – inulina, albumina, zincul, fierul, aurul, cromul Substanţele toxice care se excretă prin bilă sunt : - compuşii puternic polari, anioni sau cationi - metaboliţii conjugaţi care nu pot fi reabsorbiţi în sânge - compuşii cu masa moleculară mai mare de 300, cum ar fi hidrocarburile aromatice polinucleare, coloranţii azoici După ce au ajuns în intestin împreună cu bila, xenobioticele sau metaboliţii acestora excretaţi pe această cale pot fi eliminaţi prin fecale sau, dependent de proprietăţile lor, pot fi reabsorbiţi, intrând în ciclul enterohepatic. Metaboliţii conjugaţi pot fi de asemenea hidrolizaţi şi reabsorbiţi. 2.3. Secreţia intestinală este un proces relativ lent, care se realizează în general prin difuzia pasivă a substanţei din sânge în lumenul intestinal. Este întâlnită la compuşi cu metabolizare redusă sau care au clearance renal sau biliar scăzut. În intestinul gros a fost demonstrată existenţa unui proces de secreţie activă a acizilor şi a bazelor organice.

3. Eliminarea pulmonară Pe cale pulmonară se elimină substanţele care se găsesc în stare gazoasă la temperatura corpului, precum şi lichidele volatile. Cantitatea de lichid eliminată prin plămâni este proporţională cu tensiunea de vapori a acestuia. Astfel, lichidele foarte volatile, cum ar fi eterul etilic, se elimină aproape exclusiv pe această cale. Eliminarea se face prin difuzie simplă prin membranele alveolelor pulmonare.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 47

4. Alte căi de eliminare 4.1. Transpiraţie şi salivă: au o importanţă minoră, iar excreţia depinde de difuzia formei neionizate, liposolubile, a xenobioticului. Substanţele toxice excretate prin salivă sunt de obicei înghiţite şi sunt din nou disponibile pentru absorbţia gastrointestinală (ciclul salivar). Prin salivă se mai pot excreta şi unele metale care pot forma cu hidrogenul sulfurat provenit din procesele de putrefacţie a resturilor alimentare sulfuri ce se depun la nivelul gingiilor sub formă de lizereu, constituind un indiciu al expunerii (ex. lizereul lui Burton din intoxicaţia cu plumb). 4.2. Lapte. Secreţia xenobioticelor în lapte este deosebit de importantă, deoarece substanţa toxică poate să treacă de la mamă la sugar, sau de la vaci la populaţie, existând riscul de producere a intoxicaţiilor. Substanţele sunt excretate prin lapte prin difuzie simplă. Deoarece laptele este mai acid decât plasma (pH ≈ 6,5), compuşii bazici se pot concentra în lapte. De asemenea, laptele având un conţinut în lipide de 3-4% , xenobioticele liposolubile difuzează împreună cu lipidele din plasmă în glanda mamară şi sunt excretate în lapte în timpul lactaţiei. Printre substanţele care ating concentraţii mai mari în lapte decât în plasmă se numără: tiouracilul, streptomicina, litiul, iodul, mercurul, izoniazida, etanolul, difenilhidantoina, cloramfenicolul.

METABOLIZAREA SUBSTANŢELOR TOXICE Majoritatea xenobioticelor care pătrund în organism sunt liposolubile, proprietate care le permite să străbată membranele biologice, deci să fie absorbite şi distribuite. Această proprietate reprezintă însă un obstacol în calea eliminării lor, deoarece compuşii lipofili pot fi uşor reabsorbiţi. De aceea, eliminarea substanţelor toxice depinde în mare măsură de transformarea lor în molecule hidrosolubile, care pot fi excretate prin urină sau prin fecale. O excepţie de la această regulă o constituie eliminarea pulmonară a substanţelor volatile, în cazul cărora transformarea în compuşi hidrosolubili nevolatili scade viteza de eliminare. Totalitatea modificărilor pe care un xenobiotic le suferă în organism poartă denumirea de biotransformare sau metabolizare. Consecinţele biotransformării pot fi: Ø Creşterea eliminării compusului prin formarea unor metaboliţi care în general sunt mai hidrosolubili, ceea ce are drept urmare scăderea timpului de înjumătăţire biologică şi menţinerea la minim a potenţialului toxic.

48 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Există însă şi excepţii, în unele cazuri metabolizarea conducând la scăderea hidrosolubilităţii şi deci la reducerea excreţiei. De exemplu, acetilarea scade solubilitatea în urină a unor sulfamide, făcând posibilă cristalizarea metaboliţilor la nivelul tubilor renali şi apariţia necrozei tubulare. Ø Modificarea activităţii biologice a substanţei în sensul reducerii sau a creşterii toxicităţii. Astfel: Detoxifierea reprezintă procesul prin care în urma biotransformării se obţin metaboliţi mai puţin toxici decât compusul părinte, şi deci mai uşor excretabili Bioactivarea este procesul prin care în urma biotransformării se obţin metaboliţi mai toxici decât compusul părinte. Tipul de biotransformare suferit de un xenobiotic depinde de: Ø Structura şi proprietăţile fizico-chimice ale compusului: grupările funcţionale, stereochimia, coeficientul de partiţie Ø Enzimele care se găsesc la nivelul ţesutului expus Enzimele implicate în metabolizarea xenobioticelor: Ø Pot fi localizate în ficat sau în alte ţesuturi: piele, plămân, mucoasa nazală, ochi, tractul gastrointestinal, rinichi, pancreas, splină, inimă, creier, testicole, placentă, plasmă, eritrocite, limfocite, trombocite Ø Pot fi localizate într-un anumit tip de celulă sau într-un anumit organ Ø Spre deosebire de enzimele implicate în metabolismul intermediar, în general nu sunt specifice şi deci nu sunt întotdeauna foarte eficiente Ø Enzimele implicate în mod normal în metabolismul intermediar pot cataliza biotransformarea unui xenobiotic dacă structura acestuia este corespunzătoare Ø Un xenobiotic poate suferi mai multe tipuri de biotransformări Ø Au o localizare subcelulară particulară: în primul rând în reticulul endoplasmatic (microzomi), sau în citosol, iar cantităţi mai mici în mitocondrii, nuclei, lizozomi, peroxizomi Locul biotransformărilor: Ø Ficatul este organul implicat cel mai frecvent în biotransformarea xenobioticelor datorită: poziţiei sale, irigării sanguine bogate şi funcţiei sale metabolice, ceea ce implică un conţinut ridicat de enzime de metabolizare. Majoritatea substanţelor toxice pătrund în organism pe calea tractului gastrointestinal, de unde ajung prin intermediul venei porte direct în ficat. Pentru acest motiv, ficatul este expus la concentraţii mai mari decât majoritatea ţesuturilor.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 49

Ø Creierul. Cercetările din ultimii ani au demonstrat prezenţa în creier a unor enzime de metabolizare cum ar fi enzimele citocromului P450, UDP-glucuronoziltransferazele şi glutation-S-transferazele. Aceste enzime sunt localizate atât la nivelul barierei hemato-encefalice, în celulele endoteliale, cât şi în diferite structuri cerebrale. În creierul uman, concentraţiile cele mai ridicate de citocrom P450 au fost regăsite în măduva cerebrală şi în cerebel, iar cele mai reduse în striat şi hipocamp. De asemenea, citocromul P450 este prezent în neuroni, care reprezintă locul de acţiune al multor substanţe psihoactive. Cel mai cunoscut exemplu cu relevanţă toxicologică de biotransformare la nivelul barierei hemato-encefalice, este cel al 1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahidropiridinei (MPTP), care sub acţiunea monoaminoxidazei B mitocondriale formează ionul dihidropiridiniu (MPP+), responsabil de inducerea unui sindrom de tip Parkinson. Ø Intestinul. La nivelul mucoasei intestinale se găsesc izoenzime ale citocromului P450, glucuronoziltransferaze, sulfotransferaze şi glutationS-transferaze ce pot fi responsabile de un metabolism presitemic al primului pasaj, care la rândul său poate influenţa biodisponibilitatea orală a xenobioticelor sau bioactivarea mutagenilor şi carcinogenilor. Aceste enzime, alături de enzimele bacteriene ale microflorei intestinale, pot metaboliza poluanţi din mediu relativ stabili şi xenobiotice provenite din alimente la molecule cu acţiune mutagenă sau cancerigenă. Ø Plămânul conţine de asemenea sisteme enzimatice de metabolizare a xenobioticelor, dar în proporţie mai mică faţă de ficat. El poate juca un rol semnificativ în eliminarea metabolică sau în bioactivarea xenobioticelor cu masă moleculară mică ce sunt inhalate. Ø Nasul. Metabolismul la nivelul mucoasei nazale are implicaţii toxicologice importante, deoarece izoenzimele citocromului P450 de la acest nivel, care au o activitate catalitică mai mare decât în orice alt ţesut, pot converti unele xenobiotice din atmosferă în metaboliţi reactivi, crescând riscul de apariţie a cancerelor nazo-faringiene sau pulmonare (de exemplu, formarea nitrozaminelor în fumul de ţigare). Clasificarea reacţiilor de biotransformare a xenobioticelor (Tabel III.2): Ø Reacţii din faza I - includ reacţii de oxidare, reducere şi hidroliză şi introduc în molecula xenobioticului noi grupări funcţionale (-OH, -NH2, -NH, –COOH), sau modifică grupări existente, care pregătesc intrarea metaboliţilor obţinuţi în faza II de metabolizare. De obicei se produce o creştere moderată a hidrofiliei moleculei. Ø Reacţii din faza II – sunt cunoscute sub denumirea de reacţii de conjugare şi presupun biosinteza unui compus conjugat între substanţa

50 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

toxică (dacă posedă grupări polare), sau un metabolit polar rezultat din faza I, şi un metabolit endogen. Metaboliţii formaţi sunt mai hidrosolubili şi mai uşor excretabili. Majoritatea xenobioticelor suferă consecutiv atât reacţii din faza I cât şi reacţii din faza II. Cele care sunt puţin metabolizabile sau cele hidrosolubile foarte polare sunt excretate în mare măsură nemodificate. Tabel III.2. Căile generale de metabolizare a xenobioticelor şi localizarea lor subcelulară REACŢIE Oxidare

Reducere

Hidroliză

Glucuronoconjugare Sulfoconjugare Conjugare cu glutation Conjugare cu aminoacizi Acilare Metilare

ENZIMĂ FAZA I Alcool dehidrogenază Aldehid dehidrogenază Aldehid oxidază Xantinoxidază Monoaminoxidază Diaminoxidază Prostaglandin H sintetază Flavinmonooxigenaze Citocromul P450 Azo- şi nitroreducerea Reducerea carbonililor Reducerea disulfurilor Reducerea sulfoxizilor Reducerea chinonelor Dehalogenarea reducătoare Carboxiesteraze Peptidaze Epoxid hidroxilaza FAZA II

LOCALIZARE Citosol Mitocondrie, citosol Citosol Citosol Mitocondrie Citosol Microzomi Microzomi Microzomi Microfloră, microzomi, citosol Citosol Citosol Citosol Citosol, microzomi Microzomi Microzomi, citosol Sânge, lizozomi Microzomi, citosol Microzomi Citosol Citosol, microzomi Mitocondrie, microzomi Mitocondrie, citosol Citosol

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 51

REACŢII DIN FAZA I 1. Reacţii de oxidare Reacţiile de oxidare sunt probabil reacţiile cele mai întâlnite în biotransformarea xenobioticelor. Aceste reacţii sunt catalizate de diferite enzime sau sisteme enzimatice: A) Sistemul enzimatic al monooxigenazelor dependente de citocromul P450 (CYP450), care mai poartă şi denumirea de Oxidaze cu Funcţii Mixte Microzomale (OFMM), este cel mai important. Denumirea provine de la capacitatea acestui sistem de a încorpora unul din atomii unei molecule de oxigen în substrat (RH), formând un metabolit oxigenat (ROH) şi de a reduce celălalt atom de oxigen la apă, conform ecuaţiei: CYP450 RH + O2

2H+, 2e-

ROH + H2O

OFMM este localizat în membrana reticulului endoplasmatic neted (Fig. 3.15.). Sistemul OFMM este alcătuit din cel puţin două componente proteice: Ø o proteină heminică numită CitocromP450 (CYP450), care are funcţia de a lega substratul şi oxigenul Ø o flavoproteină denumită NADPH-CYP450 reductaza, ce conţine atât flavinmononucleotid (FMN) cât şi flavindinucleotid (FAD), şi care serveşte drept transportor de electroni de la NADPH la CYP450 Ø şi o fosfolipidă, fosfatidilcolina, care facilitează transferul de electroni de la NADPH-CYP450 reductază la CYP450 Dintre cele trei componente, CYP450 este cea mai importantă datorită rolului său vital în activarea oxigenului şi în legarea substratului. Datorită gamei foarte variate de xenobiotice pe care trebuie să le metabolizeze organismul, citocromul P450 se prezintă sub numeroase izoforme sau izoenzime. Până la ora actuală au fost identificate 750 de izoforme, dintre care la om se întâlnesc 36, numărul total fiind estimat la mai mult de 50. Aceste izoforme sunt clasificate în familii, care au o similitudine a aminoacizilor constitutivi de peste 40% (notate printr-o cifră arabă) şi subfamilii, cu o similitudine de peste 55% (notate cu o literă); ultima cifră arabă din denumire reprezintă genul individual. Familiile CYP1, CYP2 şi CYP3 din microzomii hepatici sunt asociate cu metabolismul oxidativ al majorităţii xenobioticelor şi s-a estimat că numărul total al substraturilor exogene ale CYP450 poate depăşi 200000.

52 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig.3.15. Localizarea sistemului oxidazelor cu funcţii mixte microzomale (Niesink R.J.M., et al, 1996)

Izoenzimele au specificitate de substrat diferită. De exemplu, izoformele CYP1A au afinitate pentru substraturile poliaromatice planare cum ar fi benzpirenul, în timp ce CYP2E preferă compuşii cu masă moleculară mică, cum ar fi etanolul sau acetona. Izoformele CYP450 hepatic implicate în metabolizarea medicamentelor sunt prezentate în Fig.3.16., şi se observă că mai mult de 1/3 din substanţe sunt metabolizate de o singură izoenzimă, CYP3A4, ceea ce explică frecvenţa ridicată a interacţiunilor medicamentoase care se produc prin mecanisme enzimatice.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 53

2D6 21%

2E 1 4%

3A4/5 36%

2C18/19 8% 2C8/9 17%

2B6 3%

1A1 3% 1A2 8%

Fig. 3.16. Procentul izoenzimelor CYP450 implicate în metabolizarea principalelor medicamente utilizate în terapie

Reacţii catalizate de citocromul P450: 1.1.1. Hidroxilarea alifatică Grupările metil sunt oxidate la grupări hidroximetil, iar acestea din urmă, prin oxidare nemicrozomială, pot fi oxidate în unele cazuri la acizi carboxilici (ex. tolbutamidul). Când în moleculă sunt prezente mai multe grupări metil similare, de obicei este oxidată una singură; în cazul grupărilor metil aromatice, cele mai susceptibile sunt cele din poziţia para. Catenele alchil laterale sunt adesea hidroxilate la nivelul carbonului terminal sau al penultimului atom de carbon (ex. pentobarbitalul), în timp ce gruparea izopropil poate fi hidroxilată la carbonul terţiar şi la oricare din grupările metil echivalente (Ex. ibuprofenul, Fig.3.17.). Hidroxilarea catenelor alchil grefate pe ciclurile aromatice nu urmează regulile generale, datorită influenţei nucleului aromatic. 1.1.2. Hidroxilarea aromatică Reacţia de oxidare depinde de izoenzima CYP450 care catalizează oxidarea şi de potenţialul de oxidare al compusului aromatic. Se obţin de obicei produşi fenolici, iar poziţia în care are loc hidroxilarea depinde de tipul substituenţilor de pe nucleu, conform teoriei substituţiei aromatice electrofile. Pentru compuşii monosubstituiţi ai benzenului predomină hidroxilarea în poziţia para, dar se formează în oarecare măsură şi izomerul orto. Atunci când sunt prezente mai multe nuclee fenil, de obicei este hidroxilat unul singur (ex. fenitoinul) (Fig.3.18.).

54 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

SO2NHCONHC4H9

CH3

SO2NHCONHC4H9

HOCH2 Tolbutamid

CH3

O

CH3

O CH3

CH3

HN

HN CH3

O

N H

CH3

O

O

N H

OH

O

Pentobarbital OH CH3

CH3

CH3 CH3

COOH

CH3

COOH Ibuprofen

CH3 CH3

CH3

HO COOH

Fig.3.17. Exemple de oxidări alifatice

Hidroxilarea aromatică are loc de obicei prin formarea unui intermediar epoxidic care este foarte reactiv şi instabil şi poate suferi rearanjări intramoleculare.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 55

Benzen

OH

OH OH

OH

Pirocatehina

OH Hidrochinona Fenol (principalul metabolit)

OH

OH

OH

OH

OH

1,2,4-trihidroxibenzen

Rezorcina

OH

H N

H N

O

O O

N H

O

N H

Fenitoin

Fig.3.18. Exemple de hidroxilări aromatice

1.1.3. Reacţii de epoxidare Reacţiile de epoxidare sunt extrem de importante şi pot implica atât compuşi aromatici cât şi compuşi alifatici şi aliciclici.

56 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Epoxidarea substanţelor aromatice este o etapă intermediară în hidroxilarea aromatică şi conduce la formarea de intermediari foarte reactivi, care au fost implicaţi în producerea carcinogenezei chimice şi a necrozei celulare sau tisulare. Aceşti epoxizi pot suferi o rearanjare neenzimatică cu formare de fenoli, sau pot forma dihidrodioli sub acţiunea enzimei epoxid hidrolază (Fig. 3.19). OH

O

1- Naftol OH OH

Naftalina

Naftalin epoxid

Naftalin 1,2-dihidrodiol O

HO OH

Benzpiren 7,8 diol-9,10 epoxizi HO O OH Benzpiren

Benzpiren 7,8 epoxid

O

Benzpiren 7,8 dihidrodiol

HO OH

Fig. 3.19. Exemple de epoxidare aromatică

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 57

Prin epoxidarea alifatică se formează epoxizi stabili şi persistenţi în organism (ex. dieldrinul, metabolitul stabil al insecticidului aldrin, care este principalul reziduu regăsit la animalele expuse) sau pot fi bioactivate unele substanţe toxice (ex. aflatoxina B1 , unul din cei mai puternici hepatocarcinogeni cunoscuţi) (Fig.3.20.).

Cl

Cl

Cl

Cl CCl2

CH2

CCl2

Cl

CH2

O

Cl Cl

Cl

Aldrin

Dieldrin O

O

O

O O

OCH3

O Aflatoxina B1

O Epoxidul aflatoxinei B1

Fig.3.20. Exemple de epoxidare alifatică

1.1.4. Reacţii de dealchilare: O-, N- şi S-dealchilare Un exemplu de O-dealchilare este demetilarea codeinei cu formarea morfinei care, deşi nu reprezintă metabolitul principal, este responsabilă de inducerea farmacodependenţei la administrarea cronică a codeinei. N-dealchilarea se întâlneşte frecvent în metabolizarea medicamentelor, insecticidelor sau a altor xenobiotice. Prin N-dealchilarea unor antidepresive cum ar fi amitriptilina sau fluoxetina se obţin metaboliţi care îşi păstrează activitatea farmacologică, respectiv nortriptilina şi norfluoxetina, iar prin dealchilarea cocainei se obţine norcocaina, care se pare că este responsabilă de efectele hepatotoxice ale cocainei. Nicotina, prin N-dealchilare formează nornicotina.

58 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

S-dealchilarea se întâlneşte la tioeteri, cum ar fi metilmercaptanul sau 6metiltiopurina.

N

CH3

O

H3CO

N

OH

CH3

O

HO

Codeina

OH

Morfina

N

N CH3

H

N

N Nicotina

Nornicotina

H3C S

SH H N

N

N

N

6-Metilmercaptopurina

H N

N

N

N

6-Mercaptopurina

Fig.3.21. Exemple de reacţii de dealchilare

1.1.5. Reacţii de deaminare oxidativă Deaminarea oxidativă poate avea loc în cazul aminelor alfa-substituite, cum este amfetamina. Mecanismul oxidativ urmează o cale similară cu cea a Ndealchilării, rezultând în final un metabolit carbonilic (Fig. 3.22.). Disubstituirea

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 59

carbonului din poziţia alfa inhibă deaminarea (ex. fenterminul). Unele amine secundare şi terţiare şi aminele substituite cu grupări voluminoase pot suferi deaminare direct, fără N-dealchilare, cum este cazul fenfluraminei.

CH3

CH3 + NH3

NH2

O

Amfetamina

Fenilacetona

Fig.3.22. Exemplu de reacţie de deaminare oxidativă

1.1.6. Reacţii de N-oxidare Reacţiile de oxidare a azotului pot conduce la formarea de hidroxilamine, oxime sau N-oxizi. Hidroxilaminele se formează din anilină sau din derivaţii săi substituiţi (Fig.3.23.). N-oxizii se formează din amine terţiare şi amide.

2-Acetilaminofluorenul

H

OH

NCOCH3

NCOCH 3 N-Hidroxiacetilaminofluorenul

Fig.3.23. Exemplu de N-oxidare

1.1.7. Reacţii de S-oxidare Tioeterii sunt oxidaţi la sulfoxizi, care la rândul lor sunt oxidaţi la sulfone. Această reacţie se observă la insecticide din diferite clase (carbamice, organofosforice, hidrocarburi clorurate), precum şi la medicamente din grupul fenotiazinelor (Fig.3.24). Şi flavinmonooxigenazele pot cataliza astfel de reacţii.

60 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

O S

S

N

N

R1

R

R1

R

Fenotiazine

Fig.3.24. Exemplu de reacţie de S-oxidare

1.1.8. Reacţii de P-oxidare Oxidarea fosforului conduce la transformarea fosfinelor trisubstituite în fosfin oxizi (Fig.3.25.). Această reacţie poate fi catalizată şi de flavinmonooxigenaze.

C6H5

C6H5 H3C

H3C

P

P C6H5

C6H5 O Difenilmetilfosfina

Oxidul difenilmetilfosfinei

Fig.3.25. Exemplu de P-oxidare

1.1.9. Reacţii de desulfurare oxidativă Derivaţii de acid tiofosforic şi ditiofosforic folosiţi ca insecticide pot suferi o reacţie de oxidare prin care gruparea P=S este transformată într-o grupare P=O, ceea ce conduce la creşterea activităţii inhibitoare a colinesterazei (Fig.3.26.).

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 61

S

H2C2O

P

P H2C2O

O

H2C2O

O

H2C2O

NO2

Paration

O

NO2

Paraoxon

Fig.3.26. Exemplu de desulfurare oxidativă

1.1.10. Reacţii de dehalogenare oxidativă Metabolizarea anestezicelor fluorurate prin dehidrohalogenare oxidativă conduce la formarea de metaboliţi cu hepato- şi nefrotoxicitate considerabilă. Astfel, halotanul poate genera o clorură a acidului trifluoroacetic, care este foarte reactivă şi se poate lega covalent de proteinele tisulare, transformându-le în proteine acilate cu proprietăţi antigenice (Fig.3.27.).

O CF3CHBrCl

CF3CBrClOH

CF3C

O

Proteina Cl

CF3C

Halotan

NH

Proteina

Trifluoroacetat-proteina

Fig.3.27. Dehalogenarea oxidativă a halotanului

B) Flavinmonooxigenaza (FMO) este o enzimă dependentă de NADPH şi O2, cu un mecanism de acţiune diferit de cel al CYP450 monooxigenazei, activarea oxigenului având loc înainte de legarea substratului. Specificitatea de substrat a FMO este mai largă decât a OFMM, ea putând metaboliza amine terţiare şi secundare şi diferiţi compuşi cu sulf cum ar fi sulfuri, tioeteri, tioli şi tiocarbamaţi (Fig.3.28.). Ea nu catalizează însă reacţiile de dealchilare a heteroatomilor.

62 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

N

N

O

CH3

CH3 N

N Nicotina

Nicotin-1'-N-oxidul

O S

S

CNH2

CNH2

Tiobenzamida

Tiobenzamid S-oxidul

Fig. 3.28. Exemple de oxidări catalizate de FMO

C) Oxidările nemicrozomiale sunt catalizate de enzime localizate în mitocondrii sau în citoplasmă. 1.3.1. Oxidări catalizate de alcool-dehidrogenaze Alcool-dehidrogenazele (ADH) catalizează conversia alcoolilor la aldehide şi cetone: RCH2 OH + NAD+

RCHO + NADH + H+

Reacţia este reversibilă, compuşii carbonilici fiind reduşi la alcooli. Enzima se găseşte în fracţiunea solubilă a omogenatelor tisulare din ficat, rinichi şi plămân şi este probabil cea mai importantă enzimă implicată în metabolizarea alcoolilor exogeni. Deoarece aldehidele formate prin oxidarea alcoolilor primari sunt toxice şi greu excretabile, această reacţie poate fi considerată una de bioactivare. 1.3.2. Reacţii catalizate de aldehid-dehidrogenaze Aldehid-dehidrogenazele sunt enzime care catalizează oxidarea unui număr mare de aldehide endogene şi exogene, în urma reacţiei formându-se acizii corespunzători, care pot fi apoi conjugaţi:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 63

RCHO + NAD+

RCOOH + NADH + H+

În genomul uman au fost identificate 16 gene şi două pseudogene care codifică aldehid-dehidrogenaze şi se recunoaşte existenţa unui polimorfism al acestor enzime. Deoarece aldehidele sunt compuşi electrofili foarte reactivi ce pot interacţiona cu grupările tiol şi amino inducând efecte citotoxice, genotoxice, mutagene sau carcinogene, oxidarea lor de către aldehid-dehidrogenaze (ALDH) este considerată o reacţie de detoxifiere. Aldehid-dehidrogenazele pot să conducă însă şi la formarea de metaboliţi activi, cum se petrece în timpul metabolizării tricloretilenei. Iniţial, hidrocarbura clorurată este biotransformată sub acţiunea CYP450 la tricloretanol şi apoi la cloralhidrat şi acid tricloracetic, reacţii catalizate de alcool- şi respectiv aldehiddehidrogenaze. Acidul tricloracetic, dar nu şi metaboliţii anteriori, a fost identificat a fi responsabil de producerea de efecte carcinogene şi teratogene. 1.3.3. Reacţii catalizate de aminoxidaze Se cunosc două tipuri de aminoxidaze, care catalizează deaminarea oxidativă a aminelor, atât endogene cât şi exogene. a) Monoaminoxidazele (MAO) sunt flavoproteine care se găsesc în mitocondriile celulelor din diferite ţesuturi: ficat, creier, rinichi, intestin, eritrocite. Substraturile sunt monoamine, amine secundare şi terţiare, în care amina trebuie să fie legată de o grupare metilen nesubstituită. Se cunosc două tipuri de MAO: MAOA şi MAO-B, care au preferinţe diferite pentru substraturi. MAO-A se găseşte în principal în terminaţiile nervoase adrenergice periferice şi are afinitate pentru catecolamine, în timp ce MAO-B este întâlnită în special în trombocite şi are selectivitate pentru β-feniletilaminele nefenolice lipofile. Substraturi comune sunt dopamina, tiramina şi alte feniletilamine monofenolice. Un exemplu de implicare a monoaminoxidazelor în bioactivarea unor substanţe este acela al 1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahidropiridinei (MPTP), un contaminant obţinut în procesul de sinteză a meperidinei, care este biotransformat de MAO-B. Metabolitul său MPP+ (ionul 1-metil-4-fenilpiridiniu) se acumulează în neuronii dopaminergici, producând neurotoxicitate similară cu cea din boala Parkinson (Fig.3.29).

64 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

N

CH3

N

CH3

MPP+

MPTP

Fig.3.29. Bioactivarea MPTP sub acţiunea MAO-B

b) Diaminoxidazele oxidează aminele la aldehide, dar preferă diaminele alifatice cu lanţuri de 4 sau 5 atomi de carbon. Cele cu mai mult de 9 atomi de carbon sunt oxidate de monoaminoxidaze, iar aminele secundare şi terţiare nu sunt metabolizate (Fig.3.30.):

H2N(CH2)5 NH2 + O2 + H2O Cadaverina

H2N(CH2)4CHO + NH3 + H2O2

Fig.3.30. Exemplu de reacţie catalizată de diaminoxidaze

1.3.4. Reacţii catalizate de xantin-oxidază şi xantin-dehidrogenază Xantin-oxidaza şi xantin-dehidrogenaza sunt forme diferite ale aceleiaşi enzime şi sunt interconvertibile, întâlnindu-se adesea sub denumirea de xantinoxidoreductază (XOR). Aceste enzime joacă un rol important în metabolizarea unor citostatice purinice, dar şi în formarea de specii reactive de oxigen în timpul biotransformării alcoolului etilic, radicalii hidroxil rezultaţi fiind implicaţi în inducerea cancerului de sân (Fig.3.31.).

2. Reacţii de reducere Unele grupări funcţionale cum ar fi grupările nitro, diazo, carbonil, disulfură, sulfoxid, alchene, sunt susceptibile să sufere reacţii de reducere. În funcţie de localizarea subcelulară a enzimelor implicate, aceste reacţii pot fi clasificate în:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 65

+

E ta n o l

NAD

+

A DH

A c e ta ld eh id a

+

NADH + H

X O R OX A c e ta t

N AD

+

XO RR

O2 O2

.F er itin a F e + ++

+ H 2O 2 F e ++

.

O2

OH

M o d ific a r i A D N s i c a r c in o g e n e z a

Fig.3.31. Biotransformarea alcoolului etilic catalizată de xantin-oxidoreductază

A) Reduceri microzomale 2.1.1. Reducerea nitroderivaţilor la amine primare este catalizată de nitroreductaze, probabil cu formarea de intermediari cum ar fi nitrozaminele şi hidroxilaminele (Fig. 3.32.):

66 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

NO2

NO

Nitrobenzen

Nitrozobenzen

NHOH

Fenil-hidroxilamina

NH2

Anilina

Fig.3.32. Exemple de reacţii de reducere a nitroderivaţilor

2.1.2 Reducerea azoderivaţilor de către azoreductaze este dependentă de NADPH şi implică probabil participarea citocromului P450 (Fig.3.33.):

H2N H2N

N

N

Prontosil

SO2NH2

NH2

NH2 NH2

SO2NH2

NH2

Sulfanilamida

Fig.3.33. Exemplu de reducere a azoderivaţilor

B) Reduceri nemicrozomiale 2.2.1. Reducerea aldehidelor şi cetonelor printr-o reacţie inversă a alcooldehidrogenazelor şi aldehid-dehidrogenazelor.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 67

2.2.2. Reducerea disulfurilor la componenţii tiolici prin reacţii care se desfăşoară adesea în trei etape, ultima fiind catalizată de glutation reductază, şi necesită glutationul (GSH) drept cofactor: RSSR + GSH RSSG + RSH RSSG + GSH GSSG + RSH + GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ Un exemplu de astfel de reacţie este reducerea disulfiramului (Antabus), folosit în tratamentul alcoolismului, la acid dimetil-ditiocarbamic. 2.2.3. Reducerea chinonelor prezintă un interes toxicologic deosebit deoarece această reacţie desfăşurată în mai multe etape poate conduce la obţinerea de semichinone şi hidrochinone, care la rândul lor pot fi autooxidate de oxigenul molecular, iniţiindu-se formarea de specii reactive de oxigen.

3. Reacţii de hidroliză În general, esterii şi amidele sunt hidrolizate de enzime care se găsesc în sânge, microzomii hepatici, rinichi şi alte ţesuturi. Esterii şi anumite amide sunt hidrolizaţi rapid de un grup de enzime numite carboxilesteraze. Din acest grup fac parte: colinesteraza, arilcarboxiesterazele, carboxilesterazele din microzomii hepatici şi alte enzime neclasificate. În cele mai multe cazuri, hidroliza grupărilor ester sau amidă din molecula substanţelor toxice conduce la bioinactivarea acestora, deoarece metaboliţii rezultaţi sunt mai hidrofili, iar în unele cazuri pot forma glucuronoconjugaţi. Un exemplu este inactivarea miorelaxantului succinilcolină sub acţiunea pseudocolinesterazei plasmatice (Fig. 3.34.): O N(CH 3)3

COOH

O

+

2 HO N(CH 3)3

O N(CH3)3

COOH

O Succinilcolina

Fig.3.34. Exemplu de reacţie de hidroliză catalizată de colinesterază

68 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

REACŢII DIN FAZA II Reacţiile de conjugare reprezintă probabil cele mai importante reacţii de biotransformare a xenobioticelor, deoarece conduc la creşterea hidrosolubilităţii şi deci la creşterea posibilităţii de eliminare prin urină sau prin bilă. În mod tradiţional, s-a considerat că principalele reacţii de conjugare determină dispariţia activităţii farmacologice, deoarece metaboliţii polari formaţi, pe lângă eliminarea lor crescută, au o difuziune redusă în celule şi o afinitate scăzută pentru receptori. Această opinie a fost infirmată de descoperirea faptului că morfin-6-glucuronida are o acţiune analgezică mai puternică decât a morfinei, iar unii compuşi pot forma reactivi intermediari, care au fost implicaţi în inducerea cancerelor, a reacţiilor alergice sau a leziunilor tisulare. Unele substanţe pot urma mai multe căi secvenţiale de conjugare (Fig.3.35.), iar enzimele care catalizează aceste reacţii pot prezenta stereospecificitate pentru un anumit enantiomer.

acetilare glucuronoconjugare

H2N

COOH glucuronoconjugare sulfoconjugare

glucuronoconjugare conjugare cu glicina

OH

Fig.3.35. Căile secvenţiale de conjugare pentru acidul p-aminosalicilic

1. Glucuronoconjugarea Glucuronoconjugarea este calea majoră de conjugare a xenobioticelor şi este responsabilă de formarea majorităţii metaboliţilor conjugaţi eliminaţi prin urină şi prin bilă. Reacţia are loc prin condensarea directă între substanţa toxică, sau un metabolit al acesteia rezultat din faza I, cu acidul uridin difosfat glucuronic (UDPGA) (Fig.3.36.) şi este catalizată de enzimele UDP-glucuronozil transferaze, care sunt localizate în reticulul endoplasmatic din ficat şi din alte ţesuturi ca rinichi, intestin, piele, creier, splină şi mucoasa nazală. Glucuronidarea are loc în general la nivelul unui heteroatom nucleofil bogat în electroni: oxigen, azot sau sulf. Compuşii care pot fi metabolizaţi prin glucuronoconjugare sunt deci:

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 69

Ø Ø Ø Ø Ø

alcooli alifatici şi fenoli (formează O-glucuronide eteri) acizi carboxilici (formează O-glucuronide esteri) amine aromatice şi alifatice secundare (formează N-glucuronide) grupări tiol libere (formează S-glucuronide) Anumite xenobiotice cum ar fi fenilbutazona sau sulfinpirazona au în moleculă atomi de carbon suficient de nucleofili pentru a forma Cglucuronide.

Glucozo-1-fosfat + UTP

2NAD

UTP-glucoza

UDPG-dehidrogenaza

UDP-glucuronat (UDPGA)

HO COO UGT

CH3 O

OH N H

C O

CH3

O

N H

O

HO OH

Paracetamol

Fig.3.36. Exemplu de glucuronoconjugare catalizată de UDP-glucuronozil transferaze (UGT)

2. Sulfoconjugarea Sulfoconjugarea creşte solubilitatea în apă şi deci excreţia xenobioticelor, deoarece grupările sulfonice au un pKa de 1-2. Sulfoconjugaţii vor fi deci aproape total ionizaţi în condiţii fiziologice şi vor avea un volum de distribuţie mai mic decât cel al compuşilor neconjugaţi. Reacţia este catalizată de sulfotransferaze. Acestea pot fi localizate în citosol sau în membrana aparatului Golgi a majorităţii celulelor. Doar sulfotransferazele citosolice, care se găsesc în principal în ficat, mucoasa gastrointestinală şi rinichi, sunt implicate în sulfoconjugarea xenobioticelor. Procesul de sulfoconjugare necesită activarea prealabilă a ionilor sulfat, cu formarea de 3’-fosfo-adenozin-5’-fosfosulfat (PAPS), reacţie care decurge cu consum de ATP şi de energie (Fig.3.37). Xenobioticele care pot suferi reacţii de sulfoconjugare sunt: Ø alcoolii Ø aminele aromatice Ø fenolii Ø hidroxilaminele aromatice

70 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

2-

SO4

+ ATP

1. ATP-sulfurilaza 3-Fosfoadenozin-5'-fosfosulfat + ADP + PPi

2. APS-fosfokinaza

(PAPS)

NH2 N

OH

N

O N O3SO

P

O

N

O

HN

CH3

OH OH

H2O3PO

O

PAPS

Paracetamol OSO2O

Sulfotransferaza

PAP

HN

CH3

O

Fig.3.37. Căile de sulfoconjugare

3. Conjugarea cu aminoacizi Conjugarea cu aminoacizi este o cale metabolică importantă a xenobioticelor acizi carboxilici, care formează cu glicina sau cu glutamina conjugaţi ionici solubili în apă ce pot fi excretaţi uşor în urină şi în bilă. Substanţele ce pot suferi această reacţie sunt: Ø acizii carboxilici aromatici Ø acizii carboxilici aril-alifatici Ø acizii carboxilici heterociclici Reacţia presupune formarea unei legături amidice sau peptidice între xenobiotic şi gruparea amino a unui aminoacid. Xenobioticul este iniţial activat prin formarea unui tioester cu coenzima A (Fig.3.38.). Conjugaţii rezultaţi sunt de obicei mai puţin toxici decât precursorul acid.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 71 R-COOH + ATP + CoA

R-CO-S-CoA + R'-NH2

acil sintetaza

R-CO-S-CoA + AMP

transacetilaza R-CO-NH-R' + CoASH

COOH

O

NH2CH2COOH

N H

acil sintetaza

COOH

Glicina Acid hipuric

Acid benzoic

Fig.3.38. Căile de conjugare cu aminoacizi

4. Acetilarea Aminele exogene sunt acetilate de către N-acetil transferaze, donorul de grupări acetil fiind coenzima A. Enzimele se găsesc în citosolul celulelor din ficat, mucoasa gastrică şi limfocite iar la om, la care au fost identificate două acetil transferaze distincte, există un polimorfism genetic. Xenobioticele metabolizate pe această cale sunt: Ø amine aromatice primare Ø hidrazine Ø hidrazide Ø sulfonamide Ø unele amine alifatice primare Reacţia de acetilare presupune iniţial acetilarea enzimei, urmată de adiţia substratului şi apoi de transferul grupării acetil la substrat. Produsul conjugat poate să fie mai puţin hidrosolubil decât compusul părinte, ceea ce determină o creştere a toxicităţii (ex. acetilarea izoniazidei, Fig.3.39.): CONHNH2

CO-NH-NH-COCH3

N

N

Izoniazida

Acetil-izoniazida

Fig.3.39. Exemplu de reacţie de acetilare

72 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

5. Conjugarea cu glutation Conjugarea cu glutation (GSH, γ-glutamilcisteinil glicina) mai poartă denumirea de conjugare mercapturică, deoarece metaboliţii excretaţi în final prin urină sau bilă sunt derivaţi de N-acetilcisteină. Reacţia presupune iniţial adiţia glutationului la molecula de xenobiotic, care este catalizată de glutation-Stransferaze, enzime solubile ce se găsesc în citosolul hepatocitelor, dar care au fost detectate şi în microzomi. Conjugaţii suferă ulterior o scindare enzimatică şi o acetilare, rezultând derivaţi de N-acetilcisteină sau acizi mercapturici (Fig.3.40.). În compartimentul extracelular, glutationul poate reacţiona cu compuşii reactivi electrofili şi în absenţa enzimelor dependente de GSH. Glutationul are un rol protector major în organism datorită proprietăţilor sale oxido-reducătoare şi inactivează diferite tipuri de compuşi reactivi care conţin grupări electrofile şi prezintă o mare reactivitate faţă de proteinele tisulare sau acizii nucleici. Pentru acest motiv, această reacţie de conjugare a fost considerată o cale de detoxifiere, dar recent s-a dovedit că poate fi implicată şi în bioactivarea unor substanţe. Compuşii care se pot biotransforma prin conjugare mercapturică sunt: Ø epoxizi Ø derivaţi aromatici halogenaţi Ø nitroderivaţi aromatici Ø halogenuri de alchil Ø compuşi alifatici nesaturaţi 6. Metilarea Grupările hidroxil, amino şi tiol ale compuşilor endogeni, dar şi ale xenobioticelor, pot fi metilate de mai multe metiltransferaze. Aceste enzime se găsesc în mod normal în citosol, deşi au fost descrise şi O-metiltransferaze şi Smetiltransferaze microzomiale. Donorul de grupări metil este în general S-adenozil metionina (SAM), formată din metionină şi ATP (Fig.3.41.). La fel ca şi acetilarea, reacţia de metilare are mai degrabă efect de reducere a hidrosolubilităţii decât de creştere a acesteia. Unele metale, cum ar fi mercurul, plumbul, staniul, taliul, sau nemetale ca arsenul, seleniul, telurul, pot de asemenea să fie metilate sub acţiunea microorganismelor, fapt care este deosebit de important în toxicologia mediului, deoarece compuşii metilaţi sunt absorbiţi din tractul gastrointestinal şi pot străbate barierele hemato-encefalică şi placentară mult mai uşor decât formele anorganice.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 73

S

O Glutation

G

OH

(GSH) pierdere rest glutamil

Naftalina

pierdere rest glicinil S CH2

CHCOOH

CH2

S

CH

COOH

NH2

NHCOCH3 OH

OH

Conjugat cu cisteina

Acid premercapturic H+ S

CH2

CHCOOH NHCOCH3

H2O

Acid mercapturic

Fig.3.40. Exemplu de conjugare mercapturică

N H N

N

S-Adenozil metionina (SAM)

CH3 N

Fig.3.41. Exemplu de reacţie catalizată de metiltransferaze

S-Adenozil homocisteina

74 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

REZULTATUL BIOTRANSFORMĂRII XENOBIOTICELOR 1. Inducţia enzimatică Multe medicamente, poluanţi din mediu sau alte xenobiotice, stimulează propriul metabolism sau pe cel al altor compuşi administraţi concomitent, modificându-le efectele toxice. Fenomenul se produce printr-o creştere aparentă a activităţii enzimelor de metabolizare şi poartă denumirea de inducţie enzimatică, fiind util în interpretarea rezultatelor studiilor de toxicitate cronică, a mutagenezei sau carcinogenezei, sau în explicarea unor interacţiuni medicamentoase. Deoarece pot fi induse şi propriile enzime de metabolizare, acest proces poate explica instalarea toleranţei după administrarea cronică a unor substanţe, cum ar fi de exemplu derivaţii barbiturici. Cele mai importante enzime ce pot fi induse sunt izoenzimele citocromului P450, dar fenomenul a fost observat şi în cazul UDPglucuronozil transferazelor, glutation transferazelor sau al unor reductaze. Se cunosc două tipuri de inducţie enzimatică: Ø Inducţia mediată de derivaţii barbiturici, care se pare că induc transcripţia ARN-ului mesager specific al CYP450, ceea ce determină creşterea sintezei enzimelor de metabolizare la nivelul reticulului endoplasmatic neted din ficat sau alte ţesuturi extrahepatice. Ø Inducţia mediată de hidrocarburile aromatice policiclice (HAP), care se pare că are loc prin legarea inductorului de o proteină specifică din citosol, care funcţionează ca o moleculă receptor. Complexul inductor-receptor determină formarea în nucleu a unui ARN mesager specific, iar citocromul nousintetizat este încorporat în reticulul endoplasmatic. Printre inductorii citocromului P450 se numără, în afară de derivaţii barbiturici şi de hidrocarburile aromatice policiclice: - fumul de ţigare - etanolul - compuşi din alimente (indoli, flavone, safrol, eucaliptol, xantine, peroxizi organici) - medicamente (carbamazepină, clotrimazol, eritromicină, glucocorticoizi, griseofulvină, izoniazidă, omeprazol, fenitoin, primidon, rifampicin, etc.) - insecticide organoclorurate (DDT), bifenili policloruraţi Evoluţia în timp a fenomenului de inducţie enzimatică variază în funcţie de agentul inductor şi de izoenzimele implicate. Astfel, după tratamentul cu fenobarbital efectul inductor maxim se observă după 48-72 ore, după HAP în 24 de ore, iar în cazul inductorilor mai puţin eficienţi sunt necesare 6-10 zile pentru a se atinge nivelul maxim de inducţie. UDP-glucuronozil transferazele pot fi induse de 3-metilcolantren, fumul de ţigare sau barbiturici.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 75

2. Inhibiţia enzimatică Inhibiţia enzimelor de metabolizare a xenobioticelor poate avea consecinţe majore asupra toxicităţii, iar interacţiunile medicamentoase care se explică prin acest mecanism au importanţă clinică mai mare decât cele produse prin inducţie enzimatică. Impactul inhibiţiei asupra substanţelor toxice din mediu este mai redus, dar poate avea relevanţă în situaţia expunerii la locul de muncă. Inhibiţia se poate produce în majoritatea cazurilor după administrarea unei singure doze de inhibitor. Au semnificaţie toxicologică inhibiţia citocromului P450, inhibiţia esterazelor de către insecticidele organofosforice, sau a monoaminoxidazelor de către antidepresivele IMAO. În funcţie de mecanismul prin care se produce, inhibiţia citocromului P450 este de trei tipuri: Ø Inhibiţie reversibilă- rezultă în urma interacţiunii reversibile a xenobioticului cu ionul Fe3+ din gruparea heminică a citocromului P450 sau cu situsurile lipofile ale apoproteinei. Interacţiunea are loc înainte de etapa de oxidare a ciclului catalitic, iar efectele dispar rapid după oprirea administrării inhibitorului. Dintre substanţele care interacţionează reversibil cu CYP450 fac parte: fluorochinolonele, cimetidina, unele antifungice, chinidina. Ø Inhibiţie prin complexarea CYP450. Unele alchilamine, care nu prezintă ca atare activitate inhibitorie, pot fi oxidate de CYP450 la nitrozoalcani, care pot forma complecşi stabili cu forma redusă (feroasă) a unor izoenzime. Ca urmare, enzima nu mai este disponibilă pentru activitatea catalitică şi este necesară sinteza de novo a acesteia. Efectul inhibitor este de lungă durată şi poate fi responsabil de numeroase interacţiuni medicamentoase. Substanţe care pot induce acest tip de inhibiţie sunt: antibioticele din clasa macrolidelor (troleandomicina, eritromicina, claritromicina, care sunt inhibitori selectivi ai CYP3A4), unele antiparkinsoniene (orfenadrin). Compuşii metilendioxifenil, de exemplu insecticidul piperonil butoxid, pot genera metaboliţi intermediari care formează complecşi stabili atât cu forma ferică cât şi cu cea feroasă a CYP450. Ø Inhibiţie prin formarea de substraturi suicidare. Anumite substanţe care nu sunt inhibitori ai CYP450 conţin grupări funcţionale ce pot fi oxidate de sistemul enzimatic la metaboliţi care se leagă ireversibil de enzimă. Alchenele şi alchinele pot inactiva CYP450 prin generarea de intermediari radicalici care alchilează structura hemului. Medicamente care acţionează prin acest mecanism sunt: estrogenii 17 α-acetilenici, cloramfenicolul care prin declorurare oxidativă generează un fragment acil, ciclofosfamida care poate forma acroleină şi spironolactona, prin metabolitul său 7-tio. - Şi compuşii care lezează membrana reticulului endoplasmatic în care este localizat citocromul P450 pot acţiona ca inhibitori enzimatici.

76 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

• Un tip particular de inhibiţie este inhibiţia competitvă, care apare atunci când se administrează concomitent doi compuşi metabolizaţi de aceeaşi enzimă. Gradul de inhibare a metabolizării depinde de afinitatea fiecărui compus pentru enzimă. Un exemplu cu semnificaţie toxicologică este tratamentul intoxicaţiilor cu etilenglicol sau metanol, substanţe care îşi datorează toxicitatea metaboliţilor formaţi, prin administrarea de alcool etilic, care are o afinitate mai mare pentru alcool dehidrogenază, împiedicând bioactivarea alcoolilor toxici. 3. Bioactivarea Metabolizarea xenobioticelor poate conduce la obţinerea unor metaboliţi mai puţin toxici, mai hidrofili şi deci mai uşor excretabili (detoxifiere), dar şi a unor metaboliţi cu o toxicitate mai mare decât a compusului părinte (Fig.3.42.). Biotransformarea xenobioticelor relativ inerte, cu formarea de metaboliţi intermediari reactivi, poartă denumirea de bioactivare şi reprezintă adesea evenimentul iniţial care declanşează un efect toxic. Xenobiotic

Metabolit lipsit de toxicitate

Eliminare

Metabolit reactiv

Legare de moleculele celulare (enzime, receptori, membrane, ADN)

Toxicitate (Lezare tisulara, cancer, modificari fiziologice)

Reparare celulara (repararea ADN, sinteza proteica etc.)

Fig.3.42. Relaţia între metabolismul, bioactivarea, detoxifierea şi toxicitatea unui xenobiotic

Natura şi stabilitatea metaboliţilor reactivi Metaboliţii reactivi sunt epoxizi, chinone, radicali liberi, specii reactive de oxigen, conjugaţi instabili. Datorită marii lor reactivităţi, aceşti metaboliţi sunt

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 77

adesea consideraţi a avea o durată de viaţă scurtă. Însă, datorită transportului lor de la un ţesut la altul, durata de viaţă poate creşte. Ei pot fi clasificaţi în: Ø Metaboliţi cu durată de viaţă foarte scurtă: sunt metaboliţi care se leagă în principal de enzima care îi generează, cum este cazul substraturilor suicidare, sau de proteinele adiacente. Ø Metaboliţi cu durată de viaţă scurtă: sunt metaboliţi care rămân în celulă sau se deplasează doar în celulele învecinate. Leziunile celulare sunt localizate şi se produc la locul de bioactivare. Un exemplu ar fi necroza hepatică centrolobulară indusă de tetraclorura de carbon în urma bioactivării sale la radical triclormetil. Ø Metaboliţi cu durată lungă de viaţă: sunt metaboliţi care pot fi transportaţi şi în alte celule şi ţesuturi decât cele unde sunt produşi; ei pot fi transportaţi nu numai ca atare, ci şi sub formă de conjugaţi, din care intermediarul reactiv este eliberat în ţesutul ţintă în condiţii specifice. De exemplu, aminele aromatice cancerigene sunt metabolizate în ficat la derivaţi N-hidroxilaţi care, după glucuronoconjugare, sunt transportaţi în vezica urinară unde sunt eliberaţi metaboliţii N-hidroxi la un pH acid al urinei.

Soarta în organism a metaboliţilor reactivi Aceasta depinde de natura speciilor reactive şi de fiziologia organismului şi poate fi: Ø Legarea de macromoleculele celulare : proteine, polipeptide, ARN, ADN. Această legare covalentă este considerată a fi evenimentul iniţial în procese toxice cum ar fi: mutageneza, carcinogeneza, necroza celulară. Ø Peroxidarea lipidelor poate conduce la distrugerea membranelor şi la iniţierea necrozei celulare. Ø Captarea şi inactivarea: în general se realizează prin conjugarea cu glutationul.

Reacţii prin care are loc bioactivarea 1. Reacţii de oxidare 1.1. Reacţia de epoxidare Monooxigenazele microzomiale pot converti numeroşi compuşi aromatici în epoxizi. Datorită caracterului electrofil, aceştia pot reacţiona cu grupările nucleofile ale macromoleculelor biologice, cum ar fi proteinele şi acizii nucleici, inducând necroză sau cancere. Un exemplu interesant de bioactivare pe această cale este biotransformarea brombenzenului (Fig.3.43). Epoxidul brombenzenului se poate lega covalent de

78 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

macromolecule producând leziuni tisulare, dar metabolizarea pe celelalte căi poate preveni acest efect. Calea cea mai importantă de metabolizare o constituie conjugarea cu glutationul, ea servind drept un mecanism de protecţie; doar după ce nivelele hepatice ale glutationului redus sunt mult diminuate, epoxidul se va lega semnificativ de macromolecule, producând necroză hepatică. Depleţia de glutation poate să apară în prezenţa unor doze mari de brombenzen sau după inducţia enzimelor microzomale. Alţi compuşi care pot forma epoxizi în cursul biotransformării sunt: aflatoxina B1 , benzenul, benzpirenul, bifenilii policloruraţi, tricloretilena, clorura de vinil, furosemidul. Formarea acestor metaboliţi are loc în principal la nivel hepatic. Br

Br

ne-enzimatic

microzomi

legare covalenta de macromolecule

H

NADPH + O2 brombenzen

O

H

epoxidul brombenzenului rearanjare

Br

GSH transferaza

ne-enzimatica

hidrolaza

Br

Br

OH

OH

H

H OH p-bromfenol

GS

H

3,4-dihidro-3-hidroxi-4S-glutationil-brombenzen

HO

H

3,4-dihidro3,4-dihidroxibrombenzen

Fig.3.43. Biotransformarea brombenzenului

1.2. Reacţii de N-oxidare Aminele terţiare sunt transformate în N-oxizi, care sunt în general mai puţin toxici, în timp ce aminele primare şi secundare sunt metabolizate la hidroxilamine. Acestea, prin eliminare sau prin esterificare urmată de eliminare, pot forma ioni de

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 79

nitreniu foarte reactivi. Aceşti ioni, găsindu-se în echilibru cu formele mezomere carbocationice, au o mare afinitate pentru macromoleculele nucleofile, cum ar fi acizii nucleici. Metaboliţii N-hidroxilaţi pot fi la rândul lor conjugaţi. Conjugaţii cu acid glucuronic sunt uşor excretabili, în timp ce sulfoconjugaţii pot fi instabili, având efecte mutagene, cancerigene sau puternic toxice. Acest mecanism este responsabil de hepatocarcinogenitatea acetilaminofluorenului (Fig.3.44.). OH

H

N

CH3

N

CH3

O2 O

O

CYP450 NADPH PAPS

acetilaminofluoren

sulfotransferaza SO3H O CH3

N O

HSO4

N

N

CH3 O

CH3 O

ion 1-carbeniu

ion nitreniu

CH 3

N O ion 3-carbeniu

INTERACTIUNE CU MACROMOLECULELE CELULARE (ADN)

GENOTOXICITATE

Fig.3.44. N-oxidarea acetilaminofluorenului

80 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

1.3. Reacţii de oxidare nemicrozomială sub acţiunea alcool-dehidrogenazei şi a aldehid dehidrogenazei Aceste reacţii sunt responsabile de acţiunea toxică a unor alcooli ca alcoolul metilic, sau glicoli ca etilenglicolul. Aceste substanţe îşi datorează acţiunea toxică în principal metaboliţilor lor reactivi, aldehide sau acizi, şi doar în mică măsură compusului părinte. 2. Formarea radicalilor liberi şi a speciilor active de oxigen Speciile reactive de oxigen se pot forma în timpul ciclurilor redox ale unor xenobiotice cum ar fi chinonele sau nitroderivaţii aromatici. Radicalii liberi rezultă în urma acceptării sau pierderii unui electron, sau în urma clivajului homolitic al unei duble legături. Aceste entităţi foarte reactive pot ataca componente celulare, inducând diferite fenomene toxice, iar aspectele legate de toxicologia lor vor fi tratate într-un capitol separat. 3. Reacţii de reducere 3.1. Reducerea nitroderivaţilor are loc în mai multe etape, formându-se iniţial anionul radical nitro, apoi nitrozo derivatul, radicalul nitroxil, hidroxilamina şi în final amina primară (Fig.3.45.). Fiecare din aceşti intermediari poate avea acţiune toxică. Hidroxilaminele sunt responsabile de inducerea methemoglobinemiei, în timp ce mutagenitatea şi carcinogenitatea se datorează interacţiunii anionului radical nitro, nitrozoderivaţilor sau hidroxilaminelor esterificate cu macromoleculele celulare. În timpul metabolizării se pot forma şi specii reactive de oxigen. 4. Reacţii de conjugare Deşi multă vreme s-a crezut că reacţiile din faza II, cu excepţia reacţiilor de metilare, sunt exclusiv reacţii de detoxifiere, în ultima perioadă s-a demonstrat că şi în urma conjugării pot rezulta intermediari reactivi, capabili să inducă toxicitate. 4.1. Glucuronoconjugarea În general, glucuronidele au reactivitate biologică şi chimică mai redusă decât a compuşilor părinte, fiind eliminate rapid din organism. Există însă şi excepţii, un exemplu notabil fiind cel al morfinei, care este glucuronoconjugată în intestin şi în ficat formând morfin-3-O-glucuronida şi morfin-6-O-glucuronida. Metabolitul principal este 3-O-glucuronida, care are o concentraţie sanguină de 20 de ori mai mare decât a morfinei şi care din punct de vedere farmacologic este un antagonist opiaceu şi are proprietăţi excitante. 6-O-Glucuronida, cu o concentraţie sanguină de 2 ori mai mare decât a morfinei, are o activitate analgezică de 650 de ori mai mare decât a acesteia. Astfel, efectele analgezice ale morfinei sunt rezultatul interacţiunii complexe a medicamentului şi a celor doi metaboliţi asupra receptorului opiaceu. De asemenea, se pare că morfin-6-glucuronida este capabilă

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 81

să pătrundă în creier, în ciuda hidrofiliei sale, prin plierea moleculei şi folosirea unui sistem activ de transport al anionilor.

e O

O Ar

Ar

N

Ar

N

anion radical O nitro

nitroderivat O aromatic

N

O

nitrozoderivat e , H

O

O

O

O H

OH HO

OH

Ar

O

N

radical nitroxil LEZAREA COMPONENTELOR CELULARE (proteine, acizi nucleici)

e , H

H Ar

N

OH arilhidroxilamina 2e , 2H H2O Ar

NH2

amina aromatica

Fig.3.45. Bioactivarea nitroderivaţilor aromatici

Glucuronoconjugarea este de asemenea capabilă să promoveze lezarea celulară prin facilitarea formării unor intermediari reactivi electrofili şi transportul lor la ţesuturile ţintă. Astfel, aminele aromatice pot fi N-hidroxilate şi transformate în ficat în N-glucuronide care sunt excretate în urină. La nivelul vezicii urinare, datorită pH-ului acid, pot fi hidrolizate, eliberând N-hidroxilaminele care la rândul lor se pot transforma în compuşi electrofili capabili să reacţioneze cu macromoleculele tisulare inducând tumori locale (Fig.3.46.).

82 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

ficat H NH2

N OH UDPGA

glucuronida N OH

urina glucuronida N OH H+

acid glucuronic H N OH

intermediar reactiv electrofil

Fig.3.46. Bioactivarea aminelor aromatice

O altă clasă de glucuronide reactive sunt acil glucuronidele, formate prin esterificarea acizilor carboxilici cu acidul glucuronic. Acestea au semnificaţie toxicologică importantă datorită numărului mare de medicamente care conţin grupări carboxilice şi a rolului major pe care îl are glucuronidarea în eliminarea lor. Astfel de medicamente fac parte din clasa antiinflamatoarelor nesteroidiene, a hipolipemiantelor (clofibrat), sau a anticonvulsivantelor (acid valproic), iar

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 83

utilizarea lor clinică a fost asociată cu diferite manifestări cum ar fi hepatotoxicitatea, nefropatia sau reacţiile alergice. Se pare că aceste efecte toxice sunt mediate de acil glucuronide, care pot suferi reacţii de migrare a grupării acil în timpul cărora are loc atacul macromoleculelor celulare nucleofile. Glucuronoconjugaţii estrogenilor sunt consideraţi a fi responsabili de colestaza intrahepatică care poate fi asociată cu utilizarea contraceptivelor orale, printr-un mecanism care nu a fost complet elucidat. 4.2. Sulfoconjugarea Sulfoconjugarea poate conduce la formarea de reactivi intermediari capabili să genereze metaboliţi electrofili. Substanţe care pot fi bioactivate pe această cale sunt alcoolii benzilici (Fig.3.47.), hidroxilaminele aromatice (ex. hidroxilamina acetilaminofluorenului, Fig.3.44.), acizii hidroxamici aromatici, nitroalcanii, unii compuşi aromatici policiclici. Sulfoconjugaţii rezultaţi sunt instabili şi reactivi. Ei pot pierde gruparea sulfat fie prin hidroliză spontană, fie prin acţiunea sulfatazelor, formând în final ioni nitreniu sau carboniu, capabili să reacţioneze cu proteinele şi cu acizii nucleici şi să conducă la necroză sau cancere. De asemenea, se crede că unele aziridine, analogi azotaţi ai epoxizilor care sunt mutageni foarte puternici, sar putea forma pe cale metabolică din aminoalcooli, prin intermediul sulfotransferazelor.

R2 N OSO3

N

-

R1

R1

H2 C

R3

OSO3

R2

+

SO42-

+

SO4

ion nitreniu

H2 C

-

R3

ion carboniu

Fig.3.47. Bioactivarea acizilor hidroxamici şi a alcoolilor benzilici

2-

84 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

4.3. Conjugarea cu glutationul Deşi această reacţie de conjugare este considerată mai degrabă o modalitate eficientă de inactivare a intermediarilor reactivi, ea poate totuşi conduce la toxicitate prin mai multe căi: - formarea de conjugaţi ce pot pune în libertate ioni de sulfoniu extrem de reactivi. Acest mecanism explică mutagenitatea şi carcinogenitatea dibrometanului, folosit ca insecticid, fungicid şi aditiv în combustibilii lichizi, precum şi a altor compuşi dihalogenaţi vicinali (Fig.3.48.)

X

X H

S

[Glutation] S

X

[Glutation] X INTERACTIUNE CU MACROMOLECULE NUCLEOFILE

S [Glutation] Ion sulfoniu

Fig.3.48. Bioactivarea la ion sulfoniu

- formarea unui conjugat cu cisteina care este activat de β-liază, obţinându-se intermediari reactivi ca: tioli, tiocetene, tiolactone, halogenuri de tionoacil, dependent de structura conjugatului (Fig.3.49.). Un exemplu este activarea hexaclorobutadienei, care se metabolizează la un tiol reactiv.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 85

Gly R

S

Cys

R

γ Glu

S

C

-

C

COO +

NH3

conjugat cu glutationul β−liaza

R

SH

N-acetilare

R

S

C

C HN

-

COO C

CH3

O

Fig.3.49. Bioactivarea dependentă de β-liază

- conjugarea chinonelor şi chinoniminelor, care a fost implicată în nefrotoxicitatea unor compuşi aromatici cum ar fi brombenzenul şi paminofenolul. În cazul brombenzenului, nefrotoxicitatea se datorează conjugaţilor cu glutation ai bromhidrochinonei formată în faza I de metabolizare. Restul glutation este responsabil de alegerea rinichiului ca organ ţintă, deoarece conjugatul se elimină renal, iar la acest nivel hidrochinona este oxidată la o chinonă reactivă, care se poate lega covalent direct de macromoleculele celulare sau poate produce specii reactive de oxigen prin intermediul unui ciclu redox. - conjugarea reversibilă, care permite eliberarea speciilor reactive ce au fost iniţial detoxifiate. Conjugaţii cu glutationul servesc în acest caz pentru transportul la ţintă sau pentru ţintirea unor anumite organe. Clasele de compuşi la care conjugarea cu glutationul este reversibilă sunt izocianaţii, izotiocianaţii şi alfa-beta cetonele sau aldehidele nesaturate. 4.4. Acetilarea Reacţia de acetilare a fost implicată în carcinogenitatea unor amine aromatice, care după acetilare pot fi oxidate la aril-N-hidroxiamide, care formează în final ioni de aril nitreniu (Fig.3.50.):

86 • TOXICOLOGIE GENERALĂ Ar Ar

NH2

Ar

NH

COCH3

COCH3 N OH

aril-N-hidroxiamide

Ar Ar

NH

ion arilnitreniu

O

CH3

N

C

H

O

aril-acetoxi-amide

Fig.3.50. Bioactivarea aminelor aromatice acetilate

În cazul tuberculostaticului izoniazidă, acetilarea urmată de hidroliză şi de oxidare microzomială conduce la formarea de radicali liberi acetil şi de carbocationi, care sunt responsabili de hepatotoxicitatea medicamentului (Fig.3.51.): 5. Bioactivarea în tubul digestiv - În mediul acid stomacal, nitriţii şi anumite amine pot forma nitrozamine, care sunt carcinogene puternice. - Nitraţii, în anumite condiţii, se pot transforma în nitriţi şi pot produce methemoglobinemie. - Ciclamatul este convertit de bacteriile intestinale în ciclohexilamină, care produce atrofie testiculară.

NOŢIUNI DE TOXICOCINETICĂ • 87

H O

O

H O

N

O

N

OH

N

NH2

C H

H

acetil CoA

N N

H2N

Polimorfism acetilator

izoniazida

N

N

O

N-acetil izoniazida

acetilhidrazina

H

acid izonicotinic

O

H

N

N

N

N

O

O

O

H

acetil nitrozamina

diacetilhidrazina

N

EXCRETIE URINARA

HO N

DETOXIFIERE

O acetil diazohidroxid

N

N O radical acetil

O N2 Proteina

Nu Proteina

Nu O

O cation acil

PROTEINA ACETILATA INTOXICATIE

Fig.3.51. Bioactivarea izoniazidei

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE Relaţia între doza unui compus şi toxicitatea sa este un concept fundamental în toxicologie, care a fost enunţat pentru prima dată de Paracelsus. Această relaţie implică cuantificarea efectului toxic şi stabilirea unei legături de cauzalitate cu expunerea la xenobiotic. Toxicitatea reprezintă capacitatea unei substanţe de a produce efecte toxice. Ea este o calitate intrinsecă a moleculei, dar în acelaşi timp are o valoare relativă, deoarece intensitatea efectelor produse depinde de doză, de individ şi de circumstanţele în care s-a produs intoxicaţia. Efectul toxic este rezultatul dăunător sau advers al acţiunii substanţei toxice asupra organismului, consecutiv alterării mecanismelor biochimice sau a echilibrelor fiziologice. Toxicitatea depinde deci de expunerea la compusul toxic, iar aceasta este la rândul ei determinată de doză şi de durata expunerii. Dacă se ţine cont de aceste aspecte, toxicitatea poate fi definită (Rozman & Doull, 2000) ca fiind „acumularea de leziuni pe perioade scurte sau lungi de timp, care fac organismul incapabil să funcţioneze în limitele de adaptare”. Doza este cantitatea de substanţă care pătrunsă în organism într-un anumit interval de timp (în general 24 de ore), produce un anumit efect. Ea poate face ca efectul substanţei să varieze în limite foarte largi. Astfel, dacă ne referim la medicamente, se disting trei tipuri de doze: doze terapeutice, doze toxice şi doze letale. În ceea ce priveşte noţiunea de timp, pentru toxicologie este important faptul că evoluţia în timp a unei substanţe toxice în organism (toxicocinetica) este adesea foarte diferită de evoluţia în timp a toxicităţii (toxicodinamica). De aceea, relaţiile farmacocinetică-farmacodinamică, care descriu la acelaşi individ relaţia cantitativă între efectul indus de compus şi concentraţia corespunzătoare în timp a acestuia, sunt foarte importante pentru evaluarea diagnosticului şi a prognosticului intoxicaţiilor. Efectul poate fi apreciat prin intensitatea sa, adică prin răspuns. Răspunsurile la substanţele toxice pot fi de două tipuri: Ø Răspunsuri gradate, care pot fi măsurate pe o scală continuă, de la un răspuns minim la un răspuns maxim; pot fi o modificare farmacologică, biochimică sau patologică care prezintă o variaţie procentuală sau proporţională Ø Răspunsuri cuantale, sau răspunsuri de tip „totul sau nimic”, când intensitatea efectului este măsurată prin numărul indivizilor care răspund dintr-un grup de indivizi care au fost expuşi în mod egal. Exemple de astfel de răspunsuri sunt moartea sau inducerea tumorilor.

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE • 89

Indiferent de tipul de răspuns care se foloseşte pentru aprecierea toxicităţii, relaţia doză-răspuns se bazează pe următoarele ipoteze: - a) răspunsul toxic depinde de concentraţia compusului la locul de acţiune - b) concentraţia la locul de acţiune este determinată de doză - c) răspunsul este în raport de cauzalitate cu compusul administrat Reprezentarea grafică a procentului de răspuns în funcţie de doza la care a fost expus organismul poartă denumirea de curba doză-răspuns, iar forma ei depinde de tipul de efect toxic măsurat şi de mecanismul prin care acesta se produce. De exemplu, ionul cianură se leagă foarte puternic de citocromul a3, întrerupând funcţionarea lanţului transportor de electroni din mitocondrii şi stopând astfel respiraţia celulară. Deoarece această funcţie este vitală pentru viaţa celulei, curba doză-răspuns va fi foarte abruptă. Un alt aspect important al relaţiei doză răspuns este conceptul de prag, respectiv o doză sub care probabilitatea de răspuns este egală cu zero. De exemplu, în unele cazuri este necesară ocuparea unui anumit număr de receptori pentru ca răspunsul să devină evident. Un prag poate să apară şi atunci când receptorul este complet ocupat sau saturat. De exemplu, o enzimă implicată în biotransformarea unei substanţe toxice poate fi saturată, permiţând astfel compusului să urmeze o altă cale de metabolizare, care este responsabilă de apariţia toxicităţii. Un astfel de caz este cel al paracetamolului, care la doze terapeutice are o hepatotoxicitate foarte redusă; chiar dacă se formează metabolitul toxic N-acetil-p-benzochinonimina, acesta este rapid detoxifiat prin conjugare cu glutationul. La doze mari însă, glutationul intracelular este consumat, metabolitul toxic se acumulează în celulă şi produce toxicitate hepatică fatală. În principiu, curba doză-răspuns este derivată din curba Gaussiană care descrie o distribuţie normală în sistemele biologice (Fig.4.1.). Această curbă în formă de clopot este rezultatul variaţiei biologice, ceea ce înseamnă că la dozele mici şi la dozele mari răspund puţine animale, majoritatea răspunzând în jurul dozei medii. O distribuţie Gaussiană perfectă permite obţinerea unei curbe doză-răspuns de forma unei sigmoide simetrice (Fig.4.2.). Cu cât se utilizează mai multe animale, cu atât curba este mai apropiată de o sigmoidă adevărată. Porţiunea curbei între procentul de răspuns de 16% şi cel de 84% este cea mai apropiată de liniaritate şi permite determinarea unor parametrii cum ar fi doza medie letală (DL50 ), sau doza medie eficientă (DE50). Liniaritatea curbei poate fi îmbunătăţită prin reprezentarea logaritmului dozei, care este o metodă empirică. Uneori, curba poate fi liniarizată şi prin alte metode, cum ar fi metoda probit, care converteşte procentul de letalitate în unităţi probit. Procentul de letalitate de 50% corespunde probitului 5, doza care corespunde procentului de letalitate de 84% reprezintă + 1 DS (deviaţia standard) de la DL50, iar cea care corespunde letalităţii de 16% reprezintă –1 DS.

90 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

25

Frecventa letalitatii (%)

20

15

10

5

0

0

20

40

60

80

100

Doza (mg/kg) scara logaritmica

Fig.4.1. Relaţia doză răspuns exprimată ca frecvenţa distribuţiei

% Letalitate sau % Raspuns

100

80

60

40

20

0 10

15

20

25

30

35

40

Doza (mg/kg) scara logaritmica

Fig.4.2. Curba doză-răspuns

Răspunsul toxic cel mai uşor de măsurat este letalitatea, care reprezintă un răspuns de tip cuantal. De aceea, pentru aprecierea toxicităţii acute a substanţelor se foloseşte doza medie letală (DL50), a cărei determinare este de obicei primul experiment care se realizează pentru substanţele chimice noi. DL50 este doza de compus care produce moartea a 50% din animalele expuse. Ea este o valoare virtuală, obţinută prin calcul statistic, nu o constantă biologică. Numeroşi factori pot influenţa toxicitatea, afectând astfel estimarea DL50 . Astfel de factori pot fi:

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE • 91

rasa animalului, vârsta şi greutatea, natura hranei, condiţiile de vivariu, oprirea alimentelor înainte de efectuarea testului, metoda de administrare, volumul şi natura mediului de condiţionare, durata observării animalelor. Datorită acestor variabile, pentru multe scopuri este suficientă doar determinarea ordinului de mărime a DL50 (ex. între 5 şi 50 mg/kg, între 50 şi 500 mg/kg, etc.), nu şi a valorii absolute. Doza medie letală este exprimată în mg/kg greutate corporală, precizându-se specia pe care s-a făcut determinarea, calea de administrare şi timpul de urmărire a animalelor. Metodele de testare sunt foarte bine standardizate de reglementările internaţionale pentru a evita diferenţele între laboratoare şi pentru a reduce la minim erorile. Pentru substanţele toxice din aer sau din apă se determină concentraţia letală medie (CL50), care reprezintă concentraţia ce produce moartea a 50% din animalele expuse, precizându-se în mod obligatoriu şi timpul de expunere. Rezultatele obţinute în experimentele pe animale sunt apoi extrapolate la om ţinându-se cont de anumiţi factori de securitate. Pentru o evaluare mai exactă a toxicităţii, Luckey şi Venugopal au introdus conceptul de potenţial de toxicitate: pT = - log T unde T este doza molară de substanţă, exprimată în moli/kg. Acest parametru ţine cont de numărul de molecule, respectiv numărul de atomi implicaţi în procesele fiziopatologice şi se poate aplica oricărui tip de efect. Conceptul poate contribui la explicarea şi cuantificarea mecanismelor de toxicitate şi a toxicităţii proprii a substanţei, deoarece ia în calcul numărul de atomi sau molecule prezenţi la locul de acţiune. Se face astfel o apreciere mai precisă a toxicităţii, dar conceptul este mai ales teoretic, deoarece în practică se foloseşte în continuare aproape exclusiv DL50 pentru aprecierea toxicităţii în scopuri reglementare. Relaţia doză-răspuns permite şi compararea între diferite răspunsuri, între diferite substanţe sau între diferite specii animale. Astfel, pe baza valorii DL50, substanţele toxice pot fi împărţite în diferite clase de toxicitate: Extrem de toxice DL50 ≤ 1 mg/kg Foarte toxice 1mg/kg ≤ DL50 ≤ 50 mg/kg Moderat toxice 50mg/kg ≤ DL50 ≤ 500 mg/kg Slab toxice 500mg/kg ≤ DL50 ≤ 5000 mg/kg Practic netoxice 5000mg/kg ≤ DL50 ≤ 15000 mg/kg Lipsite de toxicitate DL50 ≥ 15000 mg/kg

92 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

RISCUL ŞI EVALUAREA RISCULUI Riscul de producere a unei intoxicaţii prin substanţe chimice nu depinde numai de toxicitatea intrinsecă a moleculei, ci şi de numeroşi alţi factori, dintre care cel mai important este gradul de expunere. În măsura în care expunerea omului la aceste molecule nu poate fi evitată, este indispensabilă evaluarea toxicologică, ce urmăreşte determinarea gradului de expunere care este asociat cu absenţa riscului. Riscul este definit ca frecvenţa presupusă cu care apar efecte nedorite ca urmare a expunerii la o substanţă toxică. El poate fi exprimat ca un risc absolut, corelat direct cu substanţa toxică, sau ca un risc relativ, care reprezintă raportul dintre riscul observat la o populaţie expusă la toxic şi cel observat la o populaţie neexpusă. Anumite efecte toxice pot fi observate doar de la o doză-prag, sub care nu există răspuns detectabil. Acest nivel la care nu se observă efect (NOEL= No Observed Effect Level) se poate aplica atât la un răspuns cuantal, cum ar fi moartea sau o leziune patologică, cât şi la un răspuns ca inhibiţia unei enzime sau legarea de un receptor. Existenţa acestui prag poate fi explicată prin saturarea unei enzime sau a unui sistem de reparare fiziologică. Nivelul cel mai ridicat de doză care nu produce nici o creştere semnificativă a răspunsului advers este NOAEL (No Observed Adverse Effect Level). Acest nivel de doză nu trebuie considerat a fi complet lipsit de risc şi valoarea sa depinde de numărul nivelelor de doze testate, de numărul animalelor incluse în test şi de incidenţa de fond a răspunsurilor adverse la lotul martor neexpus. O altă doză folosită este LOAEL, nivelul de doză cel mai redus la care se observă efecte adverse (Lowest Observed Adverse Effect Level). Conceptul de doză-prag este un concept important în toxicologie, deoarece permite extrapolarea dozelor toxice obţinute în experimentele pe animale şi evaluarea ulterioară a riscului la om. Astfel, NOAEL se utilizează pentru stabilirea limitelor de expunere, cum ar fi dozele de referinţă (DRf) şi dozele zilnice admisibile (DZA). Dozele de referinţă (DRf) sau concentraţiile de referinţă (CRf) estimează expunerea zilnică la o substanţă care este presupusă a fi lipsită de efecte adverse asupra sănătăţii populaţiei umane. Doza zilnică admisibilă (DZA) este doza de substanţă care poate fi ingerată de un individ zilnic, pe parcursul întregii sale vieţi, fără a produce, pe baza cunoştinţelor actuale, efecte nedorite. Termenul a fost introdus de Comitetul de Experţi FAO/OMS pentru aditivii alimentari în 1962. Iniţial a fost utilizat pentru evaluarea aditivilor alimentari şi a reziduurilor de pesticide din alimente, iar ulterior folosirea sa a fost extinsă la substanţele chimice din alimente şi la apă. DZA se exprimă în mg compus per kg greutate corporală per zi şi poate fi calculată plecând de la valorile NOAEL prin divizarea acestora cu anumiţi factori de securitate. Valorile NOAEL se determină într-un studiu corespunzător de

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE • 93

toxicitate la animal (ex. un studiu de administrare repetată timp de 90 de zile) în care se obţin dozele zilnice în alimente la care nu se observă efecte adverse (NOAEDD = No Observed Adverse Effect Daily Dose).

NOAEL = DZA

[consumul zilnic de alimente x NOAEDD (mg/kg aliment)] greutatea corporală a animalului (kg)

= [NOAEL] / [factor de securitate (FS)]

Factorii de securitate permit extrapolarea rezultatelor de la animal la om şi ţin cont de variaţia între specii, de numărul de animale din experiment, de mecanismul de acţiune, de toxicocinetică şi de relevanţa răspunsului la animal pentru riscul la om. Valoarea factorului de securitate variază între 10 şi 2500, dependent de natura substanţei şi de datele disponibile cu privire la toxicitate; ea este în general de 100. Pentru substanţele carcinogene genotoxice se calculează pa baza unor modele matematice. Pentru alimente se mai calculează şi Nivelul Permis (NP) care poate fi obţinut din DZA:

NP (mg/kg) =

[DZA x greutatea corporală a omului (kg)] Consumul alimentar zilnic x FS adiţionali

Pentru evaluarea la om a toxicităţii aditivilor alimentari sau a poluanţilor, se recomandă ca 90% din DZA să fie atribuită alimentelor, 10% aerului (20 m3/ zi) şi 1% apei de băut. Pentru mediul înconjurător se calculează Doza Zilnică Medie pe Durata Vieţii (LADD = Lifetime Average Daily Dose), care se poate aplica atât la om cât şi la celelalte specii din mediu:

LADD =

Concentraţia toxicului x frecvenţa x fracţia x durata expunerii în mediu contactului contactului (greutatea corporală) x (durata vieţii)

Pentru mediul de muncă se calculează concentraţii ce poartă denumirea de valori prag limită. Se disting trei tipuri de praguri: - valori-prag - medie ponderală în timp, care sunt concentraţiile medii la care un muncitor poate fi expus timp de 8 ore zilnic sau 40 de ore pe săptămână, fără a se constata efecte adverse

94 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

- valori plafon, care sunt concentraţiile ce nu pot fi depăşite în nici un moment pe parcursul zilei de muncă. Se stabilesc în special pentru substanţele ale căror efecte principale se datorează cumulării în urma expunerii repetate la concentraţii curente (ex. metale grele, solvenţi organici). - Valori – prag – limită pentru perioade scurte de timp (15 minute), care nu trebuie să depăşească media ponderală zilnică şi care nu pot fi atinse de mai mult de 4 ori pe zi sau la un interval mai mic de o oră. O altă valoare des întrebuinţată în mediul de muncă, dar şi în cel comunal, este Concentraţia Maximă Admisibilă (CMA), care reprezintă concentraţia de substanţă la care muncitorii pot fi expuşi continuu, timp de 8 ore zilnic, ani în şir sau chiar întreaga viaţă, fără a produce, cu excepţia cazurilor de hipersensibilizare, nici un simptom de boală sau condiţie fizică proastă. CMA se stabilesc pentru aer, apă, sol, atât în mediul industrial cât şi în cel comunal. CMA din mediul comunal au valori mai mici decât cele din mediul industrial, deoarece în acest mediu se trăieşte timp de 24 de ore pe zi şi de asemenea trăiesc şi copii şi persoane cu diferite afecţiuni, care au o sensibilitate mai mare la acţiunea substanţelor toxice. Pentru aer, CMA se exprimă în mg/m3 aer, mg/l aer sau p.p.m. Pentru mediul înconjurător şi pentru mediul de muncă, riscul pe care îl prezintă o substanţă mai poate fi caracterizat şi cu ajutorul unor Indici Biologici de Expunere sau Biomarkeri, care sunt parametri ce permit evidenţierea absorbţiei sau a acumulării xenobioticului în organism. Aceştia pot servi ca şi criterii de apreciere a gradului de afectare şi pot fi: - a) parametri chimici: concentraţia substanţei toxice sau a metaboliţilor săi în lichidele biologice sau în ţesuturile organismului - b) parametri biochimici ce pot fi modificaţi de expunerea la substanţa toxică: ioni, glucoză, activitate enzimatică - c) parametri funcţionali: modificări ale funcţiilor fiziologice – capacitate respiratorie, reflexe, diureză - d) parametri histologici: leziuni tisulare Pentru medicamente, aprecierea riscului, respectiv a securităţii utilizării lor se face cu ajutorul următorilor parametri: 1. Indicele terapeutic = factor relativ de securitate care este raportul dintre doza medie letală şi doza medie eficientă (DE50): IT = DL50 / DE50

RELAŢII DOZĂ-EFECT ÎN TOXICOLOGIE • 95

El dă indicaţii asupra securităţii utilizării medicamentului şi anume cu cât este mai mare, cu atât securitatea relativă este mai mare. Când IT este mai mic decât 1, substanţa nu poate fi utilizată ca medicament, când IT este 1, utilizarea este periculoasă, iar când IT este mai mare de 1, ea poate fi utilizată ca medicament. Dacă IT este sub 10, riscul terapeutic este însă pronunţat (ex. glicozizii cardiotonici). 2. Marja de securitate = factorul de securitate cert este un parametru care apreciază mai exact securitatea medicamentului deoarece ţine cont de forma şi panta curbei doză-răspuns (fig.4.3.): Marja de securitate = DL1 / DE99

Fig. 4.3. Curbele doză-răspuns pentru efectul farmacologic şi pentru efectul letal

3. Limita de securitate standard (Lss): Lss = [(DL1 – DE99) / DE99] x 100 Limita de securitate standard apreciază de câte ori trebuie mărită doza eficientă pentru a se ajunge la o doză toxică. 4. Coeficientul de securitate: CS = DL50 / CMA

96 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Coeficientul de securitate indică timpul cât poate acţiona substanţa toxică fără a produce efecte nocive. El se referă la toate substanţele, nu numai la medicamente, iar valorile depind de tipul de substanţă şi de mecanismul prin care acţionează, precum şi de frecvenţa expunerii: - pentru medicamente: între 10 şi 100 - pentru aditivi alimentari: între 100 şi 1000 - pentru contaminanţi metale grele: între 1000 şi 15000 - pentru contaminanţi organici: între 15000 şi 20000 - pentru substanţe cancerigene şi mutagene: > 50.000 Toxicitatea cronică a substanţelor poate fi cuantificată în mod asemănător cu toxicitatea acută, utilizând conceptele de doză medie toxică (DT50) sau de doză medie letală (DL50 ). Acestea se determină măsurând răspunsul toxic pe o perioadă de timp, de obicei de 90 de zile, după care se reprezintă grafic procentul răspunsului în funcţie de doza exprimată în mg/kg/zi, obţinându-se curba dozărăspuns. Compararea măsurătorilor de toxicitate cronică cu cele de toxicitate acută poate evidenţia acumularea compusului în organism, permiţând o aproximare destul de grosieră a timpului său de înjumătăţire. Acumularea în organism poate fi exprimată cantitativ prin factorul de cronicitate, care este raportul dintre DL50 după o doză şi DL50 după 90 de doze (exprimată în mg/kg/zi). Dacă valoarea factorului de cronicitate este de 90, compusul este absolut cumulativ, dacă este mai mare de 2, substanţa este relativ cumulativă, iar dacă este mai mică de 2, este relativ necumulativă.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA Dacă toxicitatea este o proprietate intrinsecă a unei substanţe toxice, natura şi intensitatea manifestărilor care apar la nivelul organismului expus sunt condiţionate de o serie de factori care trebuie luaţi în considerare atunci când se face extrapolarea rezultatelor testelor de toxicitate de la animal la om, sau când se interpretează rezultatele testării clinice a medicamentelor. Aceşti factori pot fi clasificaţi în: - factori chimici, dependenţi de substanţa toxică - factori biologici, dependenţi de organismul expus - factori de mediu, determinaţi de condiţiile în care a avut loc expunerea

I.

FACTORI CHIMICI CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA

1. Doza Unul din factorii majori care influenţează potenţialul toxic al substanţelor chimice este doza. Între cantitatea de substanţă administrată şi efectul observat există o corelaţie, pentru marea majoritate a compuşilor constatându-se o proporţionalitate între doză şi efect între anumite limite. Relaţia este reprezentată grafic printr-o sigmoidă. Pentru substanţele cumulative, această proporţionalitate este valabilă numai până la o anumită valoare a dozei, peste aceasta creşterea efectului fiind mult mai mare. Relaţia se reprezintă grafic printr-o hiperbolă. 2. Structura chimică Un efect biologic este rezultatul ultim al interacţiunii dintre o substanţă şi o moleculă ţintă din organism, motiv pentru care efectele toxice ale unui compus pot fi corelate cu anumite caracteristici structurale ale acestuia. De asemenea, structura moleculei este responsabilă de proprietăţile fizico-chimice ale acesteia, dintre care unele sunt determinante pentru transportul moleculei în organism, pentru metabolizarea acesteia sau pentru interacţiunea cu ţinta moleculară, cum ar fi: lipofilia, mărimea, pKa-ul, ionizarea, chiralitatea. Atunci când se sintetizează o nouă substanţă chimică, indiferent de domeniul viitor de utilizare a acesteia, este important să se cunoască potenţialul ei toxic asupra sănătăţii omului, dar şi asupra mediului înconjurător. Datorită numărului mare de compuşi noi, dar şi a costurilor foarte ridicate ale testelor toxicologice, a devenit necesară studierea relaţiilor care există între structură şi activitatea biologică şi au fost elaborate diferite tehnici

98 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

cunoscute sub denumirea de Relaţii Cantitative Structură-Activitate (QSAR = Quantitative Structure-Activity Relationships). Aceste tehnici permit prevederea activităţii biologice a unei substanţe, plecând de la structura acesteia, chiar înaintea sintetizării ei. Ele au fost iniţial elaborate pentru prevederea efectelor farmacologice, dar utilizarea lor s-a extins tot mai mult în domeniul toxicologiei, în special în toxicologia mediului. La ora actuală există programe informatice de screening computerizat, în special pentru clasele de compuşi al căror mecanism de acţiune poate fi corelat cu anumite caracteristici structurale, cum este cazul substanţelor mutagene şi carcinogene. Se pot stabili astfel relaţii între structura chimică şi tipul de efect observat pe de o parte, şi între proprietăţile fizico-chimice şi intensitatea efectelor toxice pe de altă parte. Relaţii între structura chimică şi tipul de efect Efectul toxic al unei substanţe se bazează pe interacţiunea dintre aceasta, sau unul din metaboliţii săi, şi o moleculă din organism care reprezintă ţinta moleculară. De exemplu, pentru compuşii cu caracter electrofil ţinta moleculară este o moleculă care conţine grupări nucleofile: -NH2, -NH-, -O-, de care se pot lega covalent. Deoarece principalele molecule de interes biologic care conţin astfel de grupări nucleofile sunt ADN-ul şi proteinele, efectul ultim al unui compus electrofil poate fi mutagenitatea, necroza sau inhibiţia enzimatică. Totuşi, datorită complexităţii sistemelor biologice, numărul substanţelor toxice al căror mecanism de acţiune la nivel molecular este cunoscut este foarte redus, ceea ce face dificilă stabilirea unor relaţii structură-toxicitate. Relaţii între proprietăţile fizico-chimice ale substanţelor şi intensitatea efectelor toxice Diferiţi compuşi chimici pot induce efecte de acelaşi tip, dar care diferă sub aspectul intensităţii lor. Această comportare diferită poate fi explicată prin faptul că activitatea biologică este influenţată de două tipuri de procese: - a) Procese toxicocinetice: transport, legare de proteinele plasmatice, metabolizare, care influenţează la rândul lor concentraţia finală a substanţei în forma sa activă la nivelul ţintei moleculare - b) Procese toxicodinamice, care implică interacţiunea compusului cu ţinta moleculară. Diferenţele de comportament toxicocinetic, precum şi diferenţele de afinitate pentru ţinta moleculară se bazează pe diferenţe de proprietăţi fizico-chimice. Prin urmare, activitatea biologică va depinde de: Ø probabilitatea (Pr1) ca molecula să-şi atingă ţinta (transport) Ø probabilitatea (Pr2) ca molecula să interacţioneze cu ţinta moleculară (legare)

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 99

Probabilitatea totală (Pr) ca molecula să interacţioneze cu ţinta va fi deci egală cu produsul Pr1 x Pr2. Concentraţia ţintei moleculare (Cţ) care interacţionează cu substanţa toxică va fi deci proporţională (constanta de proporţionalitate „a”) cu cele două probabilităţi Pr1 şi Pr2 şi cu concentraţia de compus (C) la care este expus organismul: Cţ = a x Pr1 x Pr2 x C

(ecuaţia 1)

unde C este concentraţia care produce un anumit efect (ex. letalitate). Deoarece o anumită intensitate a efectului este dependentă de Cţ, ecuaţia (1) poate fi reformulată astfel: log 1/C = log Pr1 + log Pr2 + constantă

(ecuaţia 2)

aceasta reprezentând ecuaţia fundamentală pentru QSAR. Transportul unui compus chimic spre locul său de acţiune se realizează în principal prin difuzie pasivă. Constanta de difuzie depinde de anumite proprietăţi ale moleculei cum ar fi: hidrofobia, polaritatea, gradul de ionizare, forma şi mărimea moleculei. Parametrul care reflectă cel mai fidel hidrofobia unei substanţe este coeficientul de partiţie lipide-apă, sau coeficientul de partiţie octanol-apă (Kow), care permite aprecierea transportului prin membrane. Legarea substanţei toxice de ţinta sa moleculară se poate face prin legături hidrofobe, legături electrostatice şi forţe van der Waals. Impedimentele sterice au şi ele un rol în interacţiunea cu ţinta moleculară, iar compusul se poate lega şi covalent, cum este cazul reacţiei dintre agenţii electrofili şi grupările nucleofile. Proprietăţile fizico-chimice importante pentru QSAR pot fi deci clasificate în: - proprietăţi hidrofobe - proprietăţi electronice - proprietăţi sterice Anumite studii QSAR încorporează şi indici structurali sau topologici cum ar fi conectivitatea moleculară, care reflectă caracterul mai mult sau mai puţin ramificat al moleculei. Alţi parametri care pot fi utilizaţi sunt: punctul de topire, punctul de fierbere, numărul de atomi de carbon, constanta vitezei de reacţie pentru anumiţi compuşi (ex. compuşii alchilanţi). Tehnici QSAR 1. Metoda Hansch se bazează pe ecuaţia (2): log 1/C = log Pr1 + log Pr2 + constantă

100• TOXICOLOGIE GENERALĂ

Probabilitatea Pr1 (de transport) fiind dependentă de hidrofobia moleculei, poate fi exprimată prin coeficientul de partiţie lipide-apă (Kow): log 1/C = log Kow + log Pr2 + constantă

(ecuaţia 3)

Probabilitatea Pr2 (de legare) este proporţională cu constanta de echilibru (K) pentru interacţiunea cu ţinta moleculară: log Pr2 = log K + constantă

(ecuaţia 4)

Ecuaţia (2) se poate deci rescrie sub forma: log 1/C = a x log Kow + log K + constantă

(ecuaţia 5)

Pentru a realiza estimări QSAR este necesară determinarea Kow şi a K. Hansch a observat că acelaşi substituent induce aceeaşi modificare a Kow într-o serie de derivaţi analogi. Astfel, el a elaborat în 1964 o tehnică de calcul a valorii Kow pentru compuşii înrudiţi structural, utilizând o constantă de substituent π, care poate fi calculată pentru un substituent „X” cu formula: π (X) = log Kow(C6H5X) - log Kow(C6 H6) Această constantă de substituent este aditivă şi aproximativ aceeaşi pentru numeroşi compuşi înrudiţi structural. Pentru interacţiunile electrostatice şi legătura de hidrogen este importantă sarcina atomilor. Substituenţii influenţează distribuţia sarcinilor într-o moleculă prin intermediul inducţiei şi mezomeriei. Pentru a descrie efectele substituenţilor asupra distribuţiei sarcinilor, Hammett a introdus o constantă de substituent σ, a cărei determinare se bazează pe echilibrul de ionizare a acidului benzoic: C6 H5COOH

C6 H5 COO - + H +

Substituenţii de pe nucleul fenil influenţează sarcina negativă a anionului şi în consecinţă afinitatea acestui anion pentru protoni. Constanta lui Hammett σ se calculează pentru un substituent „X” cu ajutorul formulei: σ (X) = pKa (C6H4XCOOH) - pKa (C6 H5COOH) Valoarea constantei lui Hammett este pozitivă când substituentul este mai electroatrăgător decât hidrogenul şi negativă când substituentul are caracter

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 101

electroatrăgător mai slab decât hidrogenul. Valoarea constantelor σ depinde şi de poziţia substituentului pe nucleul fenil (o, m, sau p). Pentru a descrie impedimentul steric, Taft a introdus constanta lui Taft Es, care poate fi corelată cu constanta de viteză (K) pentru hidroliza acetatului de metil: CH3 COOCH3 + H2 O

CH3COOH + CH3OH

Ea se poate calcula pentru un substituent „X” cu formula: Es (X) = log K(XCH2 COOCH3) - log K(CH3 COOCH3) Cu cât substituentul este mai voluminos, cu atât valoarea Es este mai mică. Parametrii π, σ şi Es pot fi utilizaţi pentru estimarea valorilor Kow şi K din ecuaţia (5). Valoarea log K poate fi înlocuită cu: log K = b σ + c Es obţinându-se Ecuaţia lui Hansch: log 1/C = a log Kow + b σ + c Es + d

(ecuaţia 6)

Când această ecuaţie este aplicată pentru o serie de analogi structurali, Kow poate fi înlocuit cu π. Dacă se cunosc valorile experimentale ale log 1/C pentru un număr limitat de compuşi, ecuaţia lui Hansch poate fi rezolvată introducând constantele de substituent Kow, σ şi Es corespunzătoare. Dintr-un sistem de ecuaţii cu mai multe necunoscute se calculează valoarea constantelor a, b, c şi d, iar ulterior, ţinând cont de structura substanţelor, se pot determina concentraţiile care pot induce un anumit efect. Tehnica poate fi deci utilizată pentru prevederea activităţii biologice a unor compuşi care încă nu au fost sintetizaţi. Pot fi evaluate răspunsuri biologice cum ar fi: DL50, concentraţia care produce inhibiţia cu 50% a activităţii unei enzime (ex. acetilcolinesteraza), etc. 2. Tehnica Free-Wilson Această tehnică se bazează în întregime pe structura compusului. Ea se aplică doar la substanţele care sunt analogi structurali şi porneşte de la ipoteza că efectul unui substituent asupra activităţii biologice este aditiv şi independent de prezenţa altor substituenţi. Răspunsul biologic (RB) este descris de următoarea ecuaţie:

102• TOXICOLOGIE GENERALĂ

RB = Σ(Aij Sij) + K Unde:

Aij este contribuţia la răspunsul biologic al unui substituent „i” aflat în poziţia „j” a unei molecule Sij indică dacă un substituent „i” este prezent în poziţia „j” (S = 1) sau nu (S = 0)

3. Tehnicile de recunoaştere a unui model Aceste tehnici sunt utilizate pentru a stabili relaţii între structura unei substanţe şi prezenţa sau absenţa unui anumit efect, fără a lua în considerare aspectele cantitative. Studiază deci relaţiile structură-activitate. Fiecare moleculă este caracterizată printr-un număr de descriptori moleculari, care pot fi parametri ce indică prezenţa anumitor fragmente, sau eventual unele proprietăţi fizico-chimice. Descriptorul molecular care determină prezenţa sau absenţa unui anumit efect este pus în evidenţă prin analiză statistică. Factori chirali Importanţa factorilor chirali pentru toxicitatea substanţelor a fost recunoscută doar relativ recent, dar cercetările în acest domeniu sunt tot mai numeroase. Prezenţa în moleculă a unui centru de asimetrie, care este responsabil de formarea de izomeri, poate influenţa cinetica unui compus şi în consecinţă şi toxicitatea sa. De asemenea, în urma metabolizării se poate obţine un izomer specific pornind de la o moleculă care nu este asimetrică. Toate etapele toxicocinetice pot fi influenţate de chiralitate. Absorbţia este afectată doar atunci când ea se realizează printr-un transport activ. De exemplu, L-DOPA este mai uşor absorbită din tractul gastrointestinal decât izomerul D. Excreţia renală este influenţată ca urmare a secreţiei active a moleculei, iar excreţia biliară poate de asemenea prezenta stereoselectivitate. Metabolizarea este însă procesul care este cel mai semnificativ afectat de prezenţa centrilor chirali. Astfel, pot să apară următoarele efecte: - a) stereoselectivitatea de substrat, care se referă la efectul unui centru chiral preexistent în moleculă - b) stereoselectivitatea de produs, când se obţine un metabolit care prezintă centri chirali - c) inversarea configuraţiei - d) pierderea asimetriei ca rezultat al metabolizării. Atunci când se administrează amestecuri racemice, cum este cazul majorităţii medicamentelor, metabolismul selectiv semnifică faptul că fie se formează doi sau mai mulţi metaboliţi izomeri diferiţi, fie că doar unul din izomeri este metabolizat.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 103

Un exemplu notabil este cel al talidomidei, în cazul căreia doar acidul glutaramic format din enantiomerul S(-) este embriotoxic, nu şi cel format din enantiomerul R(+). Alţi factori dependenţi de substanţă care pot influenţa toxicitatea sunt: - concentraţia: acizii corosivi sunt mult mai toxici în soluţie concentrată decât sub formă diluată - solubilitatea şi ionizarea: intervin în etapa de absorbţie - volatilitatea: condiţionează pătrunderea pe cale respiratorie şi influenţează absorbţia.

II.

FACTORI BIOLOGICI CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA

1. Specia Toxicitatea unei substanţe poate să difere mult de la o specie la alta, animalele superioare fiind în general mai sensibile decât cele inferioare. Noţiunea de toxicitate selectivă a fost exploatată pentru obţinerea unor antibiotice sau a unor pesticide mai toxice pentru bacterii şi pentru dăunători decât pentru om şi pentru alte mamifere. În clasa mamiferelor, efectele toxice sunt destul de asemănătoare, pe acest fapt bazându-se extrapolarea la om a rezultatelor unor studii de toxicitate efectuate pe alte specii ca: şobolan, şoarece, iepure, câine sau maimuţă. Nu există însă nici un model animal „perfect”; pentru unele substanţe comportarea la om este similară cu cea la şobolan, pentru altele cu cea la câine. De aceea, din ce în ce mai des se urmăreşte efectuarea de studii de metabolizare a noilor medicamente pe culturi celulare umane, în dorinţa de a se obţine cât mai curând în dezvoltarea unui nou compus profilul metabolic la om. Sunt cunoscute numeroase cazuri în care metabolizarea s-a dovedit a fi diferită la subiecţii umani faţă de animalele de experienţă. Astfel, pentru medicamentul utilizat în tratamentul SIDA, zidovudina (AZT), studiile in vivo pe animale au sugerat că substanţa nu era metabolizată, pe când în studiile pe om s-a observat că este glucuronidată în proporţie de 70-80%. Această constare a avut impact asupra frecvenţei de administrare în clinică, respectiv o dată la 4 ore şi nu de 2 ori pe zi cum se preconizase iniţial pe baza studiilor pe animale. Interacţiunile medicamentoase sunt de asemenea dificil de detectat la animal datorită profilurilor metabolice diferite ale medicamentelor de la o specie la alta. În general, diferenţele de toxicitate între specii sunt determinate de diferenţe de cinetică sau de metabolizare a compusului, a căror înţelegere este esenţială pentru evaluarea corectă a siguranţei şi a riscului.

104• TOXICOLOGIE GENERALĂ

1. Diferenţe de absorbţie, distribuţie şi excreţie 1.1. Absorbţia compuşilor exogeni este dependentă de condiţiile fiziologice şi fizice de la locul de absorbţie. Absorbţia prin piele prezintă variaţii considerabile de la o specie la alta. În general, pielea este mai puţin permeabilă pentru substanţele chimice la om comparativ cu iepurii, şoarecii sau şobolanii. Absorbţia digestivă depinde de pH-ul tractului gastrointestinal, care variază în limite destul de largi de la o specie la alta. De exemplu, rodenticidul clorură de pirviniu are aceeaşi toxicitate acută la şoareci şi la şobolani după administrare intraperitoneală, în timp ce după administrare orală este mult mai toxic la şoareci (DL50 15 mg/kg) faţă de şobolani (1550 mg/kg). Absorbţia pe cale respiratorie poate fi influenţată de diferenţele de fiziologie pulmonară. De exemplu, la animalele mici, cu frecvenţă pulmonară mai mare decât a omului, cum ar fi şoarecii, vrăbiile sau canarii, toxicitatea compuşilor cu solubilitate mare în sânge, la care absorbţia este limitată de ventilaţie, va fi mai mare după expunere la aceeaşi doză. 1.2. Distribuţia compuşilor exogeni variază de la o specie la alta ca urmare a diferenţelor în ceea ce priveşte distribuţia lipidelor în organism, viteza de metabolizare şi excreţie, prezenţa unor sisteme de captare specifice la nivelul unor organe. De exemplu, porcul suportă doze mari de arsen, stibiu sau compuşi organocloruraţi datorită depozitării acestora în ţesutul adipos, care este bine dezvoltat. Concentraţia proteinelor plasmatice în funcţie de specie este o altă variabilă care, prin influenţarea gradului de legare a substanţei toxice şi deci a concentraţiei compusului liber în plasmă, poate modifica toxicitatea. 1.3. Excreţia Excreţia renală diferă de la o specie la alta în ceea ce priveşte volumul şi viteza de producere a urinei, precum şi pH-ul acesteia. Pentru compuşii care nu sunt excretaţi printr-un proces activ, diferenţele sub aspectul legării de proteine pot conduce indirect la diferenţe de excreţie urinară. Excreţia biliară este condiţionată mai ales de greutatea moleculară a substanţei, deoarece pragul greutăţii moleculare de la care o substanţă poate fi excretată prin bilă diferă mult de la o specie la alta. 2. Diferenţe de metabolizare Efectul biologic al unei substanţe depinde de concentraţia formei sale active şi de timpul cât aceasta se menţine în organism. La rândul lor, acestea sunt determinate de vitezele de biotransformare şi excreţie, de natura şi proporţia legării de macromoleculele tisulare. Cel mai frecvent, diferenţele de metabolizare între specii sunt diferenţe cantitative, deci sub aspectul vitezei de metabolizare, şi mai rar diferenţe calitative, sub aspectul unor căi diferite de biotransformare. În general, animalele mici, şoarecii de exemplu, metabolizează compuşii exogeni cu o viteză

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 105

mai mare decât animalele mari, cum ar fi omul. Astfel, la om fenilbutazona are un timp de înjumătăţire de aproximativ 3 zile, în timp ce la maimuţă, şobolan, câine, cobai, iepure, acesta variază între 3 şi 6 ore. Diferenţele de metabolizare pot fi observate atât la reacţii din faza I, cât şi la reacţii din faza II. Reacţii din faza I Reacţiile de oxidare. Diferenţele cele mai frecvent observate se referă la viteza cu care are loc oxidarea şi mai puţin la calea de metabolizare urmată. Hidroxilarea aromatică a anilinei este supusă unei astfel de variabilităţi. La anilină, atât poziţia orto cât şi cea para sunt susceptibile să sufere un atac oxidativ, cu formarea aminofenolilor corespunzători. La carnivore, cum ar fi pisica sau câinele, se formează în principal metabolitul orto, în timp ce la ierbivore, ca iepurele sau cobaiul, se obţine în principal metabolitul para. Omnivorele sunt intermediare, la acestea formându-se ambii metaboliţi, cu o preferinţă totuşi pentru metabolitul para. Deoarece p-aminofenolul este mai puţin toxic, speciile care vor metaboliza anilina în principal la acest metabolit vor avea o susceptibilitate mai redusă la acţiunea toxică a acestei substanţe. Un alt exemplu de diferenţe cantitative se referă la etilenglicol, care este metabolizat în final la acid oxalic. Toxicitatea compusului se datorează parţial acidului oxalic rezultat din calea oxidativă şi este proporţională cu procentul în care are loc formarea acestui metabolit. Pisica este cea mai sensibilă la acţiunea toxică a etilenglicolului, deoarece formează oxalat în proporţia cea mai mare, iar toxicitatea scade la şobolan şi la iepure, la acesta din urmă procentul fiind cel mai mic. N-hidroxilarea paracetamolului prezintă de asemenea diferenţe cantitative de metabolizare de la o specie la alta, fapt responsabil de variaţia hepatotoxicităţii. Astfel, şobolanul este mai rezistent la toxicitate deoarece metabolizează mai puţin paracetamol pe calea de bioactivare, în timp ce hamsterul este foarte susceptibil. În schimb, şobolanul poate N-hidroxila acetilaminofluorenul, etapă necesară în manifestarea acţiunii carcinogene a compusului. La maimuţă are loc hidroxilare aromatică în loc de N-hidroxilare şi efectul carcinogen nu se manifestă. Reacţii de hidroliză. Există numeroase esteraze şi amidaze responsabile de hidroliza esterilor şi a amidelor, şi care sunt întâlnite la majoritatea speciilor. Activitatea lor poate însă varia considerabil de la o specie la alta, ceea ce conduce la diferenţe de toxicitate. Un exemplu este insecticidul malation, care este rapid hidrolizat la mamifere, formându-se un acid dicarboxilic ce se poate conjuga şi elimina prin urină. La insecte, la care carboxiesteraza este absentă, calea principală de metabolizare este cea oxidativă, formându-se malaoxonul, un inhibitor puternic al acetilcolinesterazei (Fig.5.1.). Această diferenţă de metabolizare explică selectivitatea remarcabilă a acestui insecticid.

106• TOXICOLOGIE GENERALĂ CH3O

S P

CHCOOC2H5 CH2COOC2H5

CH3O

CH3O

S

Mamifere

P

CHCOOH CH2COOH

CH3O

S malation diacid

S malation Insecte

CH3O

S P

CH3O

CHCOOC2H5 CH2COOC2H5

conjugare si excretie

O malaoxon

Fig.5.1. Metabolismul malationului

Reacţii din faza II Unele reacţii din faza II prezintă diferenţe între specii care au fost bine caracterizate. Rezultatele unor studii sugerează existenţa unei relaţii între poziţia evolutivă a speciei şi mecanismele de conjugare (Tabel V.1.). La om şi la majoritatea mamiferelor, principalul mecanism este conjugarea cu acid glucuronic, glicină, glutamină, sulfoconjugarea, conjugarea cu glutation, acetilarea, metilarea şi sinteza de tiocianat. La unele specii de păsări şi reptile, conjugarea cu ornitină înlocuieşte conjugarea cu glicină; la plante, bacterii şi insecte, conjugarea cu glucoză în loc de acid glucuronic determină formarea de glucozide. Unele reacţii de conjugare se realizează cu anumiţi compuşi doar la un număr redus de specii. Este vorba de conjugarea cu fosfat, taurină, N-acetil-glucozamină, riboză, gliciltaurină, serină, arginină, acid formic, succinat. Anumite specii de păianjeni folosesc pentru conjugarea acizilor aromatici acidul glutamic şi arginina. În ceea ce priveşte conjugarea acizilor organici, carnivorele preferă conjugarea cu acid glucuronic, în timp ce ierbivorele pe cea cu aminoacizi, iar omnivorele le utilizează pe ambele. Deficienţele în reacţiile din faza II pot fi cauza unor diferenţe notabile în ceea ce priveşte cinetica unui xenobiotic. Cauza acestor variaţii poate fi absenţa enzimelor sau a cofactorilor, sau prezenţa lor în cantităţi reduse. Glucuronoconjugarea este unul din mecanismele de detoxifiere cele mai întâlnite la mamifere. Pisica însă, la fel ca şi speciile înrudite, are un sistem de glucuronoconjugare deficitar. Deşi pisica nu formează glucuronide ale: oaminofenolului, fenolului, p-nitrofenolului, 1- sau 2-naftolului şi morfinei, sau le formează în cantitate foarte mică, ea poate glucuronoconjuga cu uşurinţă

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 107

fenolftaleina, bilirubina, tiroxinul şi anumiţi steroizi. Ţinând cont de polimorfismul care se întâlneşte la nivelul glucuronozil transferazelor, este posibil ca aceste deficienţe să se datoreze mai degrabă absenţei glucuronozil-transferazelor corespunzătoare decât a acidului uridin difosfat glucuronic. În ceea ce priveşte acetilarea, şobolanii au o capacitate de N-acetilare foarte mare, în timp ce la câine aceasta este absentă. Omul este din acest punct de vedere o specie intermediară, dar polimorfismul acetil-transferazelor este foarte frecvent.

Tabel V.1. Reacţii de conjugare uzuale sau neobişnuite la diferite specii

Gruparea cu care se produce conjugarea Glucidică

Aminoacizi

Acetil Formil Sulfat Fosfat

Uzuală

Neobişnuită

Acid glucuronic (animale) N-acetilglucozamină (iepure) Glucoză (insecte, plante) Riboză (şobolani, şoareci) Glutamină (insecte, om) Glicină Ornitină (păsări) Glutation Arginină (căpuşe, Metionină păianjeni) Gliciltaurină (pisici) Glicilglicină (pisici) Serină (iepuri) Gruparea acetil din acetilCoA Formilare (câini, şobolani) Grupări sulfat din PAPS Formarea de fosfat monoesteri (câini, insecte)

Se poate deci concluziona că majoritatea diferenţelor între specii sunt de natură cantitativă şi se datorează variaţiilor în ceea ce priveşte concentraţia sau parametrii cinetici ai enzimelor, disponibilitatea cofactorilor, prezenţa enzimelor care catalizează reacţia inversă sau a inhibitorilor, concentraţia substratului în ţesut. Aceste diferenţe cantitative se pot datora însă şi faptului că la specii diferite pot fi preferate căi metabolice diferite, ceea ce determină diferenţe de acţiune farmacologică sau toxică.

108• TOXICOLOGIE GENERALĂ

În general, omul este capabil să realizeze toate transformările metabolice întâlnite şi la alte mamifere şi nu prezintă diferenţe particulare cu privire la prezenţa sau absenţa unei anumite căi metabolice.

3. Diferenţe fiziologice Şi unii factori fiziologici pot influenţa acţiunea toxică. De exemplu, şobolanii sunt sensibili la acţiunea unor rodenticide cum ar fi alcaloizii din Scilla maritima deoarece, spre deosebire de alte mamifere, nu au capacitatea de a vomita şi astfel nu pot elimina substanţa toxică, care este absorbită şi îşi produce efectul toxic cardiac. 2. Rasa Diferite rase ale aceleiaşi specii animale pot prezenta variaţii ale metabolizării substanţelor toxice şi deci ale toxicităţii lor. În cazul raselor umane, diferenţele se datorează în principal variaţiilor sub aspectul metabolizării, care sunt determinate de polimorfismul unor enzime implicate în biotransformarea xenobioticelor, dar şi unor diferenţe sub aspectul practicilor culturale. Sursa majoră de diferenţe culturale este probabil dieta, dar pot fi importanţi şi alţi factori, cum ar fi consumul de alcool, fumatul, mediul urban sau utilizarea medicamentelor. Există de asemenea şi diferenţe farmacologice mediate de receptori. S-au constatat astfel diferenţe între subiecţii africani şi cei de origine europeană în ceea ce priveşte răspunsul la agoniştii β-adrenoceptorului. La rasa neagră, răspunsul la terapia antihipertensivă este mai pronunţat. De asemenea, chinezii au un răspuns farmacodinamic la propranolol de două ori mai mare decât caucazienii. 3. Sexul Metabolizarea xenobioticelor poate varia în funcţie de sexul organismului. Diferenţele legate de sex devin aparente la pubertate şi se menţin pe parcursul vieţii adulte. Dependenţa de sex a biotransformării este o formă de control genetic, dar care se manifestă prin intermediul influenţelor hormonale. Din punct de vedere biochimic, diferenţele de biotransformare a xenobioticelor între cele două sexe se datorează unei combinaţii de factori, printre care se numără diferenţele în concentraţia şi activitatea enzimelor, precum şi modificările mediului lipidic în care se găsesc aceste enzime. Astfel, s-a constatat că mai multe izoenzime ale citocromului P450 sunt dependente de sex. Se pare că glanda pituitară eliberează la femele, sub controlul hipotalamusului, un aşa-numit „factor feminizant”, care este responsabil de o comportare specifică a ficatului la mamifere. La masculi, funcţia hipotalamusului este inhibată de hormoni şi glanda pituitară nu eliberează factorul feminizant.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 109

Efectul sexului asupra biotransformării xenobioticelor este adesea foarte pronunţat la animalele de experienţă, însă pare a avea o semnificaţie foarte redusă la om. Astfel, s-a constatat că şobolanii masculi adulţi metabolizează unii compuşi exogeni mult mai repede decât femelele. Un exemplu este susceptibilitatea diferită la leziunile hepatice induse de cloroform la şobolanii masculi şi şobolanii femele, acestea din urmă fiind mai sensibile. Se consideră că aceste diferenţe s-ar datora efectului testosteronului asupra activităţii enzimelor microzomiale hepatice. De aceea, tratamentul femelelor cu testosteron scade DL50, în timp ce administrarea de estradiol la masculi creşte DL50 a cloroformului. În ceea ce priveşte nefrotoxicitatea cloroformului la şoareci, s-a observat că şoarecii masculi sunt mai susceptibili. Această diferenţă poate fi anulată prin castrare şi poate fi restabilită prin administrare de androgeni la masculi. Explicaţia poate consta în faptul că testosteronul creşte metabolizarea mediată de enzimele microzomiale a cloroformului la metaboliţi toxici. Şi alte dezechilibre hormonale, în afara celor sexuale, pot modifica răspunsul animalelor la unele substanţe toxice. Este cazul hipertiroidismului, hiperinsulinemiei, stimulării axului hipofizo-corticosuprarenalian. Starea de gestaţie poate influenţa şi ea răspunsul la xenobiotice, activitatea multor enzime cum ar fi catecol-O-metiltransferaza şi monoaminoxidaza scăzând în această perioadă. Şobolanul femelă gestant este mai sensibil la acţiunea cancerigenă a etilnitrozureei, tumorile apărând cu o frecvenţă mai mare şi având o evoluţie mai rapidă. 4. Vârsta În general, diferenţele de toxicitate sunt observate la extremele de vârstă: nou-născuţi sau bătrâni, şi se datorează unor diferenţe de cinetică sau de metabolizare. Diferenţe de cinetică La nou-născuţi, absorbţia pe cale orală este mult alterată, deoarece evacuarea gastrică este lentă, iar absorbţia intestinală este crescută, datorită unei permeabilităţi mai mari a mucoasei. Acest aspect este responsabil de alergiile alimentare, care sunt frecvente la copii şi care se datorează absorbţiei de proteine şi de peptide exogene. Absorbţia cutanată şi cea la nivelul conjunctivelor sunt de asemenea crescute, ceea ce se reflectă în frecvenţa mai mare a reacţiilor cutanate. Distribuţia la nou-născut este diferită datorită permeabilităţii vasculare mai mari şi a procentului de apă crescut. Procentul de proteine plasmatice este redus, modificând legarea xenobioticelor şi crescând fracţiunea liberă, care îşi poate manifesta acţiunea farmacologică sau toxică. Astfel, lidocaina este legată doar 20% de proteinele plasmatice faţă de 70% la adulţi. Distribuţia compuşilor în anumite compartimente poate fi de asemenea modificată. De exemplu, morfina este de 3 până la 10 ori mai toxică la şobolanii nou-născuţi, din cauza unei permeabilităţi

110• TOXICOLOGIE GENERALĂ

crescute a barierei hemato-encefalice. În plus, ţesuturile şi organele noului-născut sunt constituite în proporţie mai mare din apă şi lipide, procentul de proteine şi de os fiind mai mic, iar encefalul reprezintă un procent mai mare din greutatea corporală, ceea ce favorizează pătrunderea substanţelor în SNC. Eliminarea renală este de asemenea mai redusă, deoarece funcţia renală este insuficient dezvoltată. De aceea, penicilinele şi teraciclina, care sunt excretate mai lent, pot fi mai toxice la nou-născuţi. Incidenţa mai mare a methemoglobinemiei la copiii mici a fost explicată prin faptul că aciditatea gastrică este mai redusă, ceea ce face ca flora bacteriană intestinală să se poată dezvolta în regiuni superioare, favorizând reducerea bacteriană a nitraţilor la nitriţi şi formarea methemoglobinei. La bătrâni, absorbţia pare a nu fi semnificativ afectată, deşi se observă o creştere a pH-ului sucului digestiv, o diminuare a motilităţii intestinale şi o atrofie a mucoasei cu scăderea numărului de celule care participă în procesul de absorbţie. Distribuţia este considerabil modificată fată de adulţi. Astfel, la persoanele peste 65 de ani se observă o diminuare cu 30-40% a volumului minut cardiac, ceea ce influenţează absorbţia substanţelor administrate intramuscular şi distribuţia celor care au fost deja absorbite, indiferent de calea de pătrundere. Se constată de asemenea existenţa unei cantităţi mai mici de albumine plasmatice şi de alte proteine transportoare. Prin urmare, cantitatea de substanţă liberă, capabilă să se lege de receptori, este mai mare cu 15-30%, fiind favorizată apariţia unor efecte mai intense la doze mai mici de xenobiotic decât la adult. Pe de altă parte, o dată cu înaintarea în vârstă creşte proporţia de ţesut adipos şi scad masa musculară şi apa totală, ceea ce determină modificarea volumelor de distribuţie. Pentru compuşii lipofili aceste volume cresc, fiind favorizată reţinerea în organism şi prelungirea efectului, în timp ce pentru substanţele hidrofile volumele de distribuţie scad, crescând concentraţiile plasmatice. În ceea ce priveşte excreţia, fluidul renal se diminuează cu aproximativ 1,5% pe an şi în acelaşi timp se deteriorează filtrarea glomerulară şi secreţia tubulară, reducându-se treptat eliminarea pe această cale. Acest fapt poate fi agravat de patologiile care sunt frecvente la această vârstă, cum ar fi insuficienţa cardiacă sau afecţiunile renale, care pot creşte timpul de înjumătăţire biologică a medicamentelor eliminate prin urină. Diferenţe de metabolizare Animalele cu vârste extreme au în general un metabolism redus al compuşilor xenobiotici comparativ cu adulţii. Nou-născuţi. La mamifere, imediat după naştere se iniţiază creşterea activităţii multor enzime hepatice implicate în biotransformarea compuşilor exogeni. În timpul gestaţiei, capacitatea ficatului de a desfăşura reacţii catalizate de sistemul monooxigenazelor microzomiale este foarte redusă. Ea începe să crească după naştere şi nu se observă diferenţe evidente între femelele şi masculii imaturi.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 111

Şi reacţiile din faza II pot fi dependente de vârstă. Astfel, glucuronoconjugarea multor substraturi este redusă sau absentă în ţesuturile fetale, dar creşte o dată cu înaintarea în vârstă. La multe specii, incapacitatea mamiferelor nou-născute de a forma glucuronoconjugaţi este asociată cu deficienţa de glucuroniltransferaze şi de cofactor, acid uridin difosfat glucuronic. Această deficienţă, alături de alţi factori cum ar fi excreţia lentă a conjugatului bilirubinei şi prezenţa în sânge a pregnandiolului, un inhibitor al glucuronidării, sunt responsabili de apariţia icterului neo-natal. S-a constatat de asemenea o deficienţă a conjugării cu glicină şi cu glutation la şobolanii şi la cobaii nou născuţi. În schimb, sulfoconjugarea şi acetilarea par să nu fie afectate de vârstă. Efectul bătrâneţei asupra metabolismului xenobioticelor a fost mai puţin studiat. Se pare totuşi că la şobolani activitatea monooxigenazelor microzomiale şi a glucuroniltransferazelor scade, în timp ce activitatea monoaminoxidazei creşte. Aceste modificări ale metabolismului xenobioticelor se reflectă adesea în modificări ale toxicităţii lor. De exemplu, hepatotoxicitatea paracetamolului, care este activat de enzimele CYP450, este mai scăzută la nou-născuţi decât la adulţi. 5. Factori genetici Factorii genetici care pot influenţa toxicitatea au fost foarte mult studiaţi în ultimele decenii şi se estimează că ei ar putea fi responsabili de 20 până la 40% din diferenţele inter-individuale care se semnalează în metabolizarea şi răspunsul la unele medicamente sau factori de mediu. Principalii factori genetici cu implicaţii toxicologice sunt polimorfismul enzimelor de metabolizare a xenobioticelor şi enzimopatiile. 1. Polimorfismul enzimelor de metabolizare a xenobioticelor Polimorfismul poate fi definit ca „apariţia în aceeaşi populaţie a două sau mai multe alele diferite situate pe acelaşi locus al unei gene, fiecare din ele cu o frecvenţă apreciabilă”. Polimorfismul genetic conduce deci la apariţia unor forme diferite ale unei gene şi ale produsului codificat de acestea, dintre care varianta cea mai puţin întâlnită trebuie să aibă o frecvenţă în populaţia respectivă de cel puţin 1%. Se estimează că aproximativ 30% din genele umane prezintă polimorfisme. Variaţia structurii proteinelor influenţează răspunsul la substanţele toxice prin cel puţin trei mecanisme: - afectarea fenomenelor toxicocinetice de absorbţie, distribuţie, metabolizare sau excreţie - afectarea receptorilor şi a secvenţei de reacţii biochimice care decurg din legarea xenobioticului de aceştia - afectarea mecanismelor de apărare, în special a susceptibilităţii de declanşare a unui fenomen carcinogen

112• TOXICOLOGIE GENERALĂ

Unele din enzimele implicate în metabolizarea xenobioticelor prezintă un astfel de polimorfism genetic, ceea ce face ca în populaţie să existe subgrupuri (fenotipuri) care diferă considerabil în ceea ce priveşte activitatea enzimatică. Polimorfismul enzimelor de metabolizare a xenobioticelor poate avea implicaţii toxicologice în următoarele cazuri: Ø Când toxicitatea se datorează compusului părinte şi biotransformarea la un metabolit inactiv, uşor excretabil, este dependentă de un sistem enzimatic polimorf. În acest caz, indivizii cu un deficit enzimatic vor fi mai susceptibili să dezvolte o intoxicaţie. Dacă organismul este expus concomitent la altă substanţă care inhibă enzima în cauză, indivizii cu un fenotip normal vor suferi mai uşor o intoxicaţie. Ø Când calea metabolică pe care o catalizează enzima polimorfă este calea principală de detoxifiere-eliminare, iar inhibarea sau saturarea acesteia deviază metabolismul pe o cale ce conduce la formarea unui compus reactiv; indivizii cu un deficit enzimatic vor fi mai susceptibili să dezvolte o intoxicaţie Ø Când toxicitatea este mediată de un metabolit reactiv, care se obţine pe o cale metabolică în care intervine enzima polimorfă; indivizii normali vor fi mai susceptibili să dezvolte toxicitate, în timp ce aceia cu enzima deficitară vor fi protejaţi. Sunt cunoscute şi caracterizate polimorfisme ale enzimelor din ambele faze de metabolizare. 1. Polimorfismul enzimelor citocromului P450 Izoenzimele citocromului P450 cu importanţă toxicologică sunt CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2B6, CYP2A6, CYP2E1 şi CYP3A4/5. Există studii care au evidenţiat existenţa unui polimorfism genetic (Tabel V.2.), dar nu în toate cazurile semnificaţia funcţională a fost suficient documentată. Tabel V.1. Exemple de izoenzime ale citocromului P450 polimorfe şi substraturile lor Enzimă CYP1B1 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1

Exemple de substraturi Hidrocarburi aromatice polinucleare metilate Cumarină s-warfarină, tolbutamid, AINS Omeprazol, proguanil Neuroleptice, antidepresive Etanol, nitrozamine

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 113

Un exemplu de citocrom al cărui polimorfism a fost bine studiat este CYP2D6, care este considerat a fi al doilea ca importanţă între izoformele umane implicate în metabolismul medicamentelor. Printre principalele substraturi se numără majoritatea antidepresivelor şi neurolepticelor, multe antiaritmice şi betablocante lipofile, opioide şi inhibitori ai recaptării serotoninei. Enzima nu este aparent inductibilă şi absenţa ei face ca subiectul să fie incapabil să metabolizeze substraturile. Consecinţa este atingerea unor niveluri plasmatice crescute după doze obişnuite, cu posibilitatea apariţiei efectelor adverse. Aproximativ 7% din caucazieni sunt metabolizatori lenţi, în timp ce la asiatici frecvenţa este în jur de 1%. Chinezii au o capacitate redusă de metabolizare a substraturilor CYP2D6, deşi ei nu au fost clasificaţi drept metabolizatori lenţi. Pentru acest motiv, dozele de haloperidol sau alte substraturi ale acestei izoenzime prescrise în China sunt mai reduse. În populaţia umană există însă şi metabolizatori ultrarapizi, care au gene CYP2D6 duplicate, multiplicate sau amplificate, la care dozele de neuroleptice necesare sunt chiar de 3 ori mai mari decât cele uzuale. Cea mai mare frecvenţă a acestui tip de polimorfism se întâlneşte în Etiopia (29%) şi în Arabia Saudită (20%), pe când în Spania ea este de 7%. O altă consecinţă a acestui fenomen, pe lângă necesitatea creşterii dozelor terapeutice, este posibilitatea formării unor concentraţii crescute din metabolitul primar. În cazul codeinei, al cărei metabolit primar este morfina, există riscul instalării farmacodependenţei în urma tratamentului cu antitusiv. 2. Polimorfismul alcool dehidrogenazei şi aldehid dehidrogenazei Polimorfismul acestor enzime are importanţă toxicologică în special prin implicarea lor în metabolizarea alcoolului etilic. Polimorfismul alcool dehidrogenazei implică izoenzima ADH2. Forma atipică a enzimei are capacitatea de a metaboliza mult mai rapid etanolul, iar incidenţa ei în populaţia umană este de 90% la chinezi şi japonezi, faţă de 5% la caucazieini. Asiaticii vor metaboliza deci alcoolul mai repede decât europenii. În ceea ce priveşte aldehid dehidrogenaza, forma activă a enzimei lipseşte la aproximativ 50% din japonezi şi chinezi, ceea ce explică incidenţa mai mare la aceştia a înroşirii feţei, palpitaţiilor şi tahicardiei după consumul de alcool. Deficienţa de aldehid dehidrogenază nu a fost observată la caucazieni şi la rasa neagră. 3. Polimorfismul colinesterazei plasmatice Acest polimorfism a fost descoperit în urma unor accidente terapeutice la folosirea în anestezie a relaxantului muscular succinilcolina. Enzima atipică are o activitate hidrolitică scăzută, ceea ce conduce la creşterea considerabilă a timpului de înjumătăţire al medicamentului şi în consecinţă la apnee prelungită care poate fi fatală.

114• TOXICOLOGIE GENERALĂ

4. Polimorfismul paraoxonazei Paraoxonaza este o arilesterază serică care hidrolizează paraoxonul, metabolitul activ al parationului, la para nitrofenol şi dietilfosfat, compuşi inactivi. Forma polimorfă are o activitate hidrolitică scăzută, care corespunde la a treia sau a şasea parte din activitatea catalitică normală. La persoanele cu enzimă atipică, riscul de producere a intoxicaţiilor cu paration este mult mai mare, fapt important în special în cazul expunerii profesionale. 5. Polimorfismul epoxid hidrolazei Epoxid hidrolazele (EH) reprezintă o familie de enzime care hidratează epoxizii simpli la dioli vicinali şi epoxizii arenelor la trans-dihidrodioli. La mamifere au fost caracterizate cinci clase de epoxid hidrolaze, din care cea mai importantă din punct de vedere toxicologic este forma microzomială, care prezintă o largă specificitate de substrat. Enzima are rolul de a inactiva printre altele epoxizii hidrocarburilor polinucleare cancerigene, prevenind iniţierea procesului cancerigen. Forma polimorfă are o activitate hidrolitică scăzută, iar cercetările recente au evidenţiat o corelaţie între genotipul EH şi frecvenţa carcinomului hepatocelular, a cancerului ovarian sau a unor afecţiuni pulmonare. 6. Polimorfismul acetiltransferazelor Polimorfismul acestor enzime a fost mult studiat şi a condus la împărţirea populaţiei umane în două fenotipuri: fenotipul acetilator lent şi fenotipul acetilator rapid. Fenotipul acetilator lent, care se întâlneşte în proporţie diferită în populaţia umană dependent de originea rasială (Tabel V.3.), se află la originea a numeroase reacţii adverse la medicamente (Tabel V.4.).

Tabel V.3. Distribuţia fenotipului acetilator în diferite grupuri etnice Grupul etnic Eschimoşi Japonezi Latino-americani Americani rasa neagră Americani rasa albă Africani Indieni Britanici Egipteni

Acetilatori rapizi (%) 95-100 88 70 52 48 43 39 38 18

Medicament Izoniazidă Izoniazidă Izoniazidă Izoniazidă Izoniazidă Sulfametazină Izoniazidă Sulfametazină Izoniazidă

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 115

Fenotipul acetilator este un factor important în toxicitatea izoniazidei. Astfel, la acetilatorii lenţi are loc o inactivare mai lentă a medicamentului, care se poate astfel acumula producând o neuropatie periferică. De asemenea, la acetilatorii lenţi s-a observat o incidenţă crescută a cancerului în cazul expunerii la amine aromatice şi heterociclice, datorită capacităţii reduse de detoxifiere.

Tabel V.4. Efecte adverse corelate cu fenotipul acetilator Xenobiotic Izoniazida Izoniazida Procainamida Hidralazina Fenelzin Amine aromatice

Efectul advers Neuropatie periferică Lezare hepatică Lupus eritematos

Incidenţa Mai mare la acetilatorii lenţi Mai mare la acetilatorii lenţi Mai mare la acetilatorii lenţi

Greată, ameţeală Cancerul vezicii urinare

Mai mare la acetilatorii lenţi Mai mare la acetilatorii lenţi

7. Polimorfismul altor enzime din faza II Şi alte enzime din faza II pot prezenta un polimorfism care permite explicarea unor diferenţe de toxicitate. Astfel, diferenţele de conjugare cu glutationul a metabolitului activ al paracetamolului, N-acetil-p-bezochinonimina, ar putea explica parţial diferenţele de susceptibilitate la efectele hepatotoxice ale acestui medicament. S-au semnalat de asemenea şi polimorfisme ale sulfotransferazelor sau ale glucuronoziltransferazelor, dar implicaţiile toxicologice ale acestora nu sunt complet elucidate. 2. Enzimopatiile – determină o modificare a răspunsului la substanţa toxică. Un exemplu este Deficienţa de glucozo-6-fosfat dehidrogenază, care este o maladie genetică, gena responsabilă fiind localizată pe cromozomul X. Ea este asociată cu susceptibilitatea apariţiei crizelor hemolitice la persoanele afectate cărora li se administrează substanţe oxidante (medicamente, nitroderivaţi sau aminoderivaţi aromatici): primachin, sulfanilamidă, acetanilidă, fenilhidrazină. Frecvenţa enzimopatiei este mai mare la indivizii de rasă albă din regiunea mediteraneană şi la cei din rasa neagră. Deoarece rolul enzimei în eritrocit este de a menţine un nivel de NADPH care să asigure cantitatea de glutation redus necesară protejării hemoglobinei de acţiunea agenţilor oxidanţi, deficitul său fragilizează hematiile şi favorizează hemoliza.

116• TOXICOLOGIE GENERALĂ

6. Starea patologică Existenţa unor leziuni sau a unor deficienţe organice poate afecta considerabil cinetica şi metabolismul compuşilor exogeni, influenţând toxicitatea acestora. În plus, expunerea cronică la o substanţă toxică poate induce leziuni patologice care pot modifica cinetica acesteia la o expunere ulterioară. 1. Afecţiunile digestive şi sindromul de malabsorbţie pot afecta absorbţia xenobioticelor din tractul gastrointestinal. 2. Afecţiunile hepatice Deoarece ficatul este sediul major al biotransformării xenobioticelor, afecţiunile hepatice au efectul cel mai semnificativ asupra toxicităţii. Leziunile hepatice pot influenţa cinetica substanţelor exogene prin următoarele mecanisme: - modificarea activităţii enzimatice de la acest nivel - modificarea fluxului sanguin - modificarea concentraţiilor de albumină plasmatică şi deci a legării substanţei a) Modificarea activităţii enzimatice poate să apară în cazul unor afecţiuni de tipul hepatitelor şi cirozei, care reduc reacţiile de metabolizare din faza II, cum ar fi acetilarea, glucuronoconjugarea şi sulfoconjugarea, precum şi nivelul de citocrom P450. Consecinţa este creşterea nivelelor sanguine ale xenobioticelor. Icterul obstructiv poate scădea metabolismul xenobioticelor ca o consecinţă a acumulării de săruri biliare, care acţionează ca inhibitori ai unor enzime. Deoarece ficatul este sediul sintezei colinesterazelor, leziunile hepatice au drept consecinţă reducerea metabolizării substraturilor acestei enzime: aspirină, procaină, succinilcolină. b) Modificarea fluxului sanguin care se întâlneşte în afecţiunile colestatice poate afecta clearance-ul unor medicamente c) Modificarea concentraţiilor de albumină plasmatică poate să apară în cazul unor afecţiuni hepatice cronice, deoarece ficatul reprezintă sediul sintezei acestor compuşi. Pentru xenobioticele puternic legate de proteinele plasmatice, consecinţa este creşterea semnificativă a concentraţiilor plasmatice ale formei libere, cu posibilitatea apariţiei de fenomene toxice, în special la medicamentele cu indice terapeutic mic. De exemplu, anestezia cu tiopental poate fi prelungită la persoanele cu afecţiuni hepatice cronice, care au un nivel redus de albumine plasmatice. 3. Afecţiunile renale pot modifica efectele toxice ale xenobioticelor prin: - mecanism direct, ca urmare a alterării funcţiilor de excreţie şi de metabolizare ale rinichiului

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 117

- mecanism indirect, consecutiv efectului insuficienţei renale asupra metabolismului hepatic. Astfel, la animalele cu insuficienţă renală s-a constatat o scădere a conţinutului de citocrom P450 din ficat. S-a observat că timpii de înjumătăţire ai tolbutamidului, tiopentalului, hexobarbitalului şi cloramfenicolului sunt prelungiţi la pacienţii cu afectare renală. 4. Afecţiunile cardiovasculare severe influenţează circulaţia hepatică şi renală, perturbând funcţiile de metabolizare şi de excreţie ale acestor organe, fapt care se reflectă în modificarea toxicităţii unor substanţe. 5. Afecţiunile osoase cresc toxicitatea unor substanţe care se acumulează la acest nivel, cum ar fi plumbul. 6. Afecţiunile căilor respiratorii, cum ar fi astmul, cresc sensibilitatea la acţiunea unor poluanţi atmosferici ca dioxidul de sulf. 7. Deshidratarea creşte sensibilitatea la acţiunea toxică a compuşilor hidrosolubili (staniu, plumb), dar nu influenţează toxicitatea acută a substanţelor liposolubile. 8. Bolile infecţioase pot afecta metabolismul, în special ca urmare a creşterii nivelelor de interferon endogen, care modifică activitatea unor enzime de metabolizare. 7. Alţi factori dependenţi de organism care influenţează toxicitatea substanţelor sunt: bioritmul şi efortul fizic.

III. FACTORI DE MEDIU CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA 1. Substanţe din mediu Omul este expus, concomitent sau secvenţial, la un mare număr de substanţe din mediu, care pot pătrunde în organism pe căi diferite. Poate cele mai cunoscute exemple de amestecuri chimice sunt cele din fumul de ţigară sau din apa, aerul şi solul din zonele de depozitare a deşeurilor. Amestecurile de substanţe chimice sunt ubicuitare în aerul pe care îl respirăm, în alimentele pe care le consumăm şi în apa pe care o bem. Printre amestecurile de substanţe chimice din mediu cele mai importante din punct de vedere toxicologic se numără gazele de eşapament ale automobilelor, produşii secundari rezultaţi în urma dezinfectării apei de băut prin clorurare sau ozonare, dioxina şi compuşii înrudiţi care se formează prin arderea incompletă a deşeurilor. Xenobioticele din mediu pot interacţiona între ele sau pot modifica toxicitatea substanţelor medicamentoase. Alte surse de substanţe exogene sunt alimentele şi medicamentele. Componenţii alimentari pot influenţa toxicitatea medicamentelor sau a poluanţilor

118• TOXICOLOGIE GENERALĂ

din mediu, iar medicamentele pot interacţiona între ele atunci când sunt administrate concomitent. Cu excepţia interacţiunilor medicamentoase, pentru care există protocoale de studiu deja validate, studiul interacţiunilor cu substanţele din mediu, sau a acestora între ele, este dificil de realizat şi presupune dezvoltarea unor protocoale experimentale inovatoare şi eficiente, în vederea examinării concomitente a tuturor organelor ţintă şi a elucidării mecanismelor de acţiune. În acest sens, folosirea unor modele farmacocinetice-farmacodinamice elaborate pe baze fiziologice s-a dovedit a fi deosebit de utilă. Consecinţele interacţiunilor dintre substanţe Toxicitatea unui compus poate fi modificată prin expunerea prealabilă, simultană sau consecutivă la o altă substanţă, efectele putându-se adiţiona, amplifica sau anula. În Fig.5.2. sunt prezentate situaţiile posibile în cazul interacţiunii dintre două substanţe. Reprezentarea este cunoscută sub denumirea de izobologramă.

doza A (

DA DE50A

)

antagonism

1

absenta interactiunii Ef. partial aditiv

Ef. aditiv

potentare

1

doza B (

DB DE50B

)

Fig.5.2. Izobolele corespunzătoare pentru mai multe situaţii posibile de interacţiune între două substanţe

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 119

1. Efectul aditiv presupune că răspunsul toxic rezultat în urma administrării a două substanţe este suma răspunsurilor individuale. În această situaţie practic nu are loc o interacţiune. 2. Sinergismul presupune că răspunsul toxic al celor două substanţe, administrate concomitent sau secvenţial, este mai mare decât suma răspunsurilor individuale, iar pentru unul din compuşi toxicitatea sa intrinsecă este nulă sau foarte redusă. Un exemplu îl constituie folosirea sinergiştilor insecticidelor, cum ar fi piperonil butoxidul (sesamex), care cresc toxicitatea insecticidelor la insecte prin inhibarea citocromului P450 al acestora, împiedicând astfel detoxifierea. Acest compus are de fapt o acţiune bifazică, el fiind atât inhibitor cât şi inductor al CYP450, dar efectul inhibitor se manifestă mult mai rapid decât cel inductor, ceea ce face posibilă utilizarea sa. 3. Potenţarea conduce şi ea la creşterea răspunsului toxic peste suma răspunsurilor individuale, dar în acest caz ambii compuşi au o toxicitate apreciabilă atunci când sunt administraţi separat. Un exemplu este cel al interacţiunii dintre malation, insecticid organofosforic cu toxicitate redusă la mamifere datorită hidrolizei rapide, cu un alt insecticid organofosforic, EPN. Asocierea determină creşterea semnificativă a toxicităţii malationului, deoarece EPN inhibă carboxiesteraza responsabilă de inactivarea prin hidroliză. 4. Antagonismul are loc atunci când una din substanţe scade efectul toxic al celeilalte. Acest fenomen este exploatat în tratamentul intoxicaţiilor prin folosirea de antidoturi. 5. Inducţia şi inhibiţia enzimatică pot conduce la modificarea metabolismului uneia din substanţe, cu consecinţe asupra toxicităţii acesteia. Nivelele la care se produc interacţiunile dintre substanţe Interacţiunile dintre substanţe pot avea loc la diferite nivele, care includ absorbţia, distribuţia, metabolizarea, excreţia, locul acţiunii toxice sau mecanismele de reparare. Exemple de astfel de interacţiuni sunt prezentate în Tabelul V.4.. Interacţiuni medicamentoase Aceste interacţiuni au drept consecinţă fie apariţia de reacţii adverse, unele foarte grave, la doze terapeutice ale medicamentelor administrate, fie reducerea răspunsului farmacologic şi ineficienţa tratamentului. Interacţiunile medicamentoase se pot produce prin mecanism chimic, farmacocinetic sau farmacodinamic şi pot fi influenţate de vârstă şi de factori genetici. Cele mai numeroase sunt interacţiunile farmacocinetice şi pot avea loc la nivelul absorbţiei din tractul gastrointestinal, la nivelul legării de proteinele

120• TOXICOLOGIE GENERALĂ

plasmatice, la nivelul excreţiei şi la nivelul metabolizării. Interacţiunile la nivelul metabolizării se explică prin inducţie sau prin inhibiţie enzimatică şi conduc adesea la reacţii foarte serioase. Interacţiunile la nivelul receptorilor sunt în general interacţiuni antagoniste şi sunt exploatate pentru obţinerea de antidoturi care acţionează prin mecanism competitiv. Tabel V.4. Bazele chimice şi biologice ale interacţiunilor dintre substanţele toxice Bazele interacţiunii Chimică

Absorbţia

Distribuţia

Sinergism sau potenţare

Antagonism

Formarea nitrozaminelor din nitriţi şi amine

Dimetihidrazina reacţionează in vivo cu piridoxal fosfatul, formând o hidrazonă şi inducând o depleţie a depozitelor tisulare ale acestui cofactor enzimatic Zincul din alimente inhibă parţial toxicitatea plumbului şi prin scăderea procentului de plumb absorbit din alimente

Neurotoxicitatea insecticidului organofosforic EPN este crescută de hidrocarburile alifatice cu 6 atomi de carbon şi datorită creşterii absorbţiei prin piele După tratamentul cu derivaţi de ditiocarbamat, tiuram cresc nivelele cerebrale de plumb

Excreţia

Scăderea excreţiei renale de penicilină la asocierea cu probenecid

Metabolizarea

Compuşii organofosforici profenfos, sulprofos, potenţează toxicitatea malationului prin inhibarea esterazei care îl detoxifică.

Interacţiunea la nivelul receptorilor Interacţiunea la alt nivel decât cel al receptorilor (antagonism funcţional) Interacţiune cu ADN-ul

Seleniul protejează împotriva toxicităţii cadmiului prin scăderea concentraţiilor de cadmiu din ficat şi rinichi şi prin redistribuirea cadmiului din testicule, de pe proteinele de legare cu masă moleculară mică pe cele cu masă moleculară mare. Arsenul antagonizează parţial efectele seleniului, prin creşterea excreţiei biliare a acestuia. Seleniul inhibă leziunile hepatice şi incidenţa tumorilor hepatice induse de 2-acetilaminofluoren prin deplasarea metabolismului pe o cale de detoxifiere. Blocarea receptorilor acetilcolinei de către atropină în intoxicaţiile cu insecticide organofosforice Interacţiunea histaminei şi a nordrenalinei, cu efecte asupra vasodilataţiei şi a presiunii sanguine Inducţia reparării ADN-ului după expunere la agenţi alchilanţi

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 121

Interacţiuni cu compuşi din dietă Regimul alimentar, prin conţinutul său în diferiţi compuşi nutritivi sau nu, poate modifica toxicitatea substanţelor. Mecanismele prin care componenţii din dietă pot modula toxicitatea xenobioticelor sunt: - efectele asupra absorbţiei - efectele asupra metabolismului - inactivarea metaboliţilor reactivi - inducţia reparării ADN - inhibarea proliferării celulelor canceroase prin modularea comunicării intracelulare, a expresiei oncogenelor şi a reglării hormonale - toxicitatea selectivă - inducerea diferenţierii - imunomodulare 1. Proteinele În general, o dietă săracă în proteine scade activitatea OFMM în ficatul de şobolan, efectele fiind dependente de sex şi de substrat. De exemplu, N-demetilarea aminopirinei şi hidroxilarea hexobarbitalului sunt scăzute în principal la masculi, în timp ce hidroxilarea anilinei este redusă la ambele sexe. De asemenea, s-a observat o scădere a activităţii azoreductazelor, consecinţa fiind creşterea gravităţii efectelor carcinogene ale dimetilaminoazobenzenului. Stricnina, care este detoxifiată de OFMM, este mai toxică la animalele cu o dietă săracă în proteine, în timp ce tetraclorura de carbon, care este bioactivată de aceleaşi enzime, este mai puţin toxică. Şi reacţiile din faza II pot fi afectate. Astfel, glucuronidarea cloramfenicolului este redusă la cobaii cu deficit de proteine. 2. Lipidele O dietă deficitară în acizi graşi nesaturaţi conduce în general la o reducere a activităţii citocromului P450 la şobolan. Lipidele par a fi necesare pentru ca efectul inductorilor enzimatici, cum ar fi fenobarbitalul, să fie complet exprimat. Totuşi, la animalele cu o dietă bogată în lipide s-a observat o incidenţă crescută a cancerelor de sân şi de colon, care pare a fi corelată în special cu evenimentele din faza de promovare. 3. Glucidele O dietă bogată în glucide are la şobolan un efect asemănător cu cel al unui aport proteic scăzut, scăzând activitatea unor enzime ale citocromului P450. Deoarece şobolanii tind să echilibreze aportul caloric total, această constatare ar putea reflecta mai degrabă un aport scăzut de proteine. 4. Vitaminele Deficienţele vitaminice conduc de obicei la o reducere a activităţii OFMM, deşi există şi unele excepţii. Deficienţa de riboflavină determină o creştere a hidroxilării anilinei, cu toate că în acelaşi timp produce o scădere a hidroxilării

122• TOXICOLOGIE GENERALĂ

benzpirenului. Deficienţa de vitamină C scade activitatea atât a enzimelor din faza I cât şi a glucuronoziltransferazelor. Deficienţele de vitamine A şi E scad activitatea OFMM, în timp deficienţa de tiamină produce o creştere a acestei activităţi. 5. Mineralele Modificarea aportului de minerale prin dietă poate afecta activitatea OFMM. Astfel, un exces de cobalt, cadmiu, mangan şi plumb în dietă poate produce o creştere a nivelurilor hepatice de glutation şi o scădere a conţinutului în citocrom P450. Un aport scăzut de calciu şi fier în dietă favorizează absorbţia cadmiului şi a plumbului. Seleniul are un rol important în procesele de detoxifiere, deoarece intră în compoziţia unor enzime cum ar fi glutation peroxidaza, cu rol în inactivarea peroxidului de hidrogen şi a peroxizilor organici. 6. Factori ne-nutritivi din dietă Unii compuşi din alimente cum ar fi cafeina, etanolul, anumite flavonoide (tangeretin, nobiletin), pot induce enzimele citocromului P450, dintre care unele sunt implicate în formarea de metaboliţi reactivi, mutageni. Sulfura de dialil din usturoi, precum şi metabolitul său dialil sulfona, inhibă ireversibil CYP2E1, acesta fiind probabil mecanismul prin care este blocat procesul carcinogen. Fenetil izotiocianatul, un produs de degradare a unor vegetale din familia cruciferelor, are de asemenea acţiune blocantă, iar naringeninul din grapefruit inhibă CYP1A2. Vanilina, aldehida cinamică şi cumarina induc unele mecanisme de reparare a ADN, iar componentele din ceai, printre care acidul galic, protejează împotriva mutaţiilor induse de radiaţiile UV în culturi bacteriene. Catechinele şi galocatechinele din ceaiul verde au efecte antimutagene şi anticarcinogene prin prevenirea inhibării comunicării intracelulare induse de unele carcinogene. Fitoestrogenii au rol protector împotriva tumorilor dependente de hormonii sexuali, în special împotriva tumorilor mamare şi de prostrată. Beta carotenul şi cantaxantina au efecte anticarcinogene şi imunomodulatoare. 2. Temperatura Variaţiile de temperatură reprezintă o formă de stres şi de aceea pot produce modificări mediate prin interacţiuni hormonale. Temperatura poate determina: - creşterea toxicităţii atât la temperaturi scăzute cât şi la temperaturi ridicate, de exemplu creşterea toxicităţii cafeinei la şoareci; - creşterea toxicităţii o dată cu creşterea temperaturii, cum este cazul Damfetaminei, a cărei toxicitate este mai redusă la temperaturi joase. 3. Radiaţiile ionizante În general, radiaţiile ionizante reduc viteza de metabolizare a xenobioticelor, atât in vivo, cât şi în preparate enzimatice.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ TOXICITATEA • 123

4. Lumina 5. Umiditatea 6. Altitudinea 7. Factorii de stres (zgomotul)

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ În ultimii 30 de ani, toxicologia a progresat rapid, transformându-se dintr-o ştiinţă descriptivă într-o disciplină capabilă să explice efectele toxice. Această modificare a fost iniţiată de scandalul talidomidei, iar printre moleculele care au contribuit la înţelegerea mecanismelor toxicităţii se numără paracetamolul, brombenzenul şi paraquatul. Explicarea mecanismelor prin care se produc efectele toxice este deosebit de importantă deoarece: - permite identificarea cauzei toxicităţii - contribuie la prevenirea toxicităţii prin metode chimice sau biologice - furnizează o bază raţională pentru extrapolarea datelor de toxicitate de la animalele de experienţă la om şi pentru evaluarea riscurilor asociate cu expunerea la anumite xenobiotice. Efectele exercitate de substanţele toxice asupra organismului sunt foarte variate şi destul de dificil de sistematizat. Ele pot fi clasificate după locul unde se produc, după reversibilitatea sau nu a fenomenelor, după momentul în care apar. a) Efecte locale şi efecte sistemice Efectele locale sunt cele care se exercită imediat, la locul de contact între substanţa toxică şi organism. Ele se pot datora acţiunii moleculelor caustice asupra tubului digestiv, a materialelor corosive asupra pielii, sau a gazelor iritante asupra mucoasei căilor respiratorii, şi sunt consecinţa unei distrugeri generalizate a celulelor. Efectele sistemice se manifestă după ce xenobioticul a fost absorbit şi distribuit în organism. Substanţa toxică nu afectează în mod egal toate organele, ci acţionează mai specific la nivelul unuia sau a câtorva organe care poartă denumirea de organe ţintă. Organul ţintă este fie organul care are o sensibilitate mai mare la acţiunea compusului toxic, fie organul în care acesta se găseşte în concentraţie mai mare. De exemplu, neuronii şi miocardul, la nivelul cărora au loc schimburi transmembranare rapide şi care sunt în consecinţă dependenţi de ATP-ul rezultat în urma oxidărilor mitocondriale, sunt deosebit de sensibili la acţiunea substanţelor care induc hipoxie, cum este monoxidul de carbon. De asemenea, celulele cu diviziune rapidă, cum sunt cele ale măduvei hematoformatoare sau ale mucoasei intestinale, sunt foarte sensibile la acţiunea toxicilor mitotici ca medicamentele citostatice.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 125

O concentraţie mai mare a substanţei toxice la nivelul unui organ poate fi determinată de particularităţile toxicocinetice ale acesteia. Deoarece prin ficat şi prin rinichi trece cea mai mare parte a volumului sanguin, aceste organe sunt expuse la concentraţii mari de xenobiotice. Metilmercurul, o substanţă lipofilă, poate străbate bariera hemato-encefalică, producând efecte la nivelul SNC, spre deosebire de compuşii anorganici ai mercurului care acţionează toxic în principal la nivelul tractului gastrointestinal şi al rinichilor. În ochi şi în urechea internă se găsesc cantităţi mai mari de melanină. Substanţele cu afinitate mare pentru melanină, cum sunt clorochinul şi kanamicina, se pot acumula la aceste nivele, unde după expunere prelungită pot induce leziuni. Bioactivarea conduce la formarea unor metaboliţi mai reactivi, care sunt mai susceptibili să acţioneze asupra celulelor adiacente locului de producere. Deoarece ficatul este locul major de biotransformare, el poate fi lezat de numeroase substanţe toxice. De exemplu, tetraclorura de carbon produce necroză hepatică centrolobulară, care poate fi corelată cu un conţinut mai mare de citocrom P450 în această regiune a ficatului. b) Efecte reversibile şi efecte ireversibile Efectele reversibile sunt cele care dispar după întreruperea expunerii la substanţa toxică. Efectele ireversibile sunt efectele care persistă, sau chiar progresează, după întreruperea expunerii. În categoria efectelor ireversibile se încadrează cancerul, mutaţiile, distrugerea neuronilor şi ciroza hepatică. c) Efecte imediate şi efecte tardive Efectele imediate apar rapid, după o expunere unică la substanţa toxică, de exemplu cele observate în intoxicaţiile acute cu substanţe caustice, cu cianuri sau stricnină. Efectele tardive sunt efectele care apar după o perioadă de latenţă, mai mult sau mai puţin lungă. Exemple sunt efectele carcinogene sau efectele observate în intoxicaţia cu paraquat. Datorită multitudinii de substanţe toxice existente, şi căile prin care acestea ajung să producă efecte toxice sunt diferite (Fig.6.1.). Uneori simpla prezenţă a substanţei la anumite nivele critice din organism este suficientă pentru a produce toxicitate, cum ar fi precipitarea unor compuşi în tubii renali cu instalarea insuficienţei renale (calea A). Alteori, xenobioticul trebuie să interacţioneze cu un receptor (calea B), sau după bioactivare interacţionează cu molecule endogene, perturbând funcţia sau structura celulară (calea C). Afectarea celulară poate declanşa mecanisme de reparare la nivel molecular, celular sau tisular (calea D), iar

126 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

atunci când aceste mecanisme sunt depăşite se instalează toxicitatea. Necroza celulară, cancerul şi fibroza sunt fenomene toxice care urmează aceste 4 etape.

S ubstanta toxica

1 E xpunere

A

2 Interactiune cu molecula tinta

B

3 Disfunctie celulara Lezare

C

4 E secul repararii

D

T O X I C I T A T E

Fig.6.1. Etapele potenţiale ale dezvoltării toxicităţii după expunerea la xenobiotice

Efectele toxice se produc deci în majoritatea cazurilor ca urmare a interacţiunii moleculei de xenobiotic sau a unui metabolit activ cu ţinte moleculare care pot fi: proteine, coenzime, lipide, acizi nucleici.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 127

1. Proteinele a) Proteinele de structură cum ar fi cele din membranele organitelor celulare sunt frecvent lezate. Proteinele din colagen sunt însă afectate mult mai rar. b) Proteinele cu funcţie enzimatică sunt frecvent ţinta acţiunii substanţelor toxice. Efectele asupra enzimelor pot fi specifice, reversibile sau nu, când xenobioticul trebuie să îndeplinească anumite cerinţe structurale pentru a se putea lega de centrul activ al enzimei (ex. insecticidele organofosforice care inhibă acetilcolinesteraza), sau nespecifice, cum este cazul unor metale ca plumbul şi mercurul ce pot inhiba foarte multe enzime, indiferent de activitatea lor, datorită legării de grupările tiolice ale acestora. c) Transportori, cum ar fi hemoglobina, a cărei funcţie de transport al oxigenului poate fi afectată prin legarea monoxidului de carbon sau prin oxidarea la methemoglobină. 2. Coenzimele Coenzimele sunt indispensabile pentru funcţionarea enzimelor. Unele substanţe toxice le pot inhiba sinteza, în timp ce altele pot chelata ionul metalic al coenzimei (ex. ditiocarbamaţii care chelatează ioni de Zn sau Cu). 3. Lipidele Lipidele pot fi atacate de radicalii liberi care iniţiază peroxidarea acizilor graşi din compoziţia lor, producând necroză. De asemenea, unele anestezice liposolubile ca halotanul sau eterul se pot acumula în membrana celulară prin dizolvare în fracţiunea lipidică a acesteia şi determină perturbări ale transportului transmembranar de oxigen sau de glucoză. 4. Acizii nucleici Formarea de legături covalente între acizii nucleici în curs de replicare şi substanţa toxică sau metaboliţii activi ai acesteia poate conduce la mutaţii, cancere sau teratogeneză. Antimetaboliţii ca aminopterina pot fi încorporaţi în molecula acizilor nucleici şi interferează în replicarea acestora. Aceste ţinte moleculare trebuie să fie accesibile şi să prezinte o anumită reactivitate sau configuraţie spaţială care să le permită interacţiunea cu substanţa toxică (Fig.6.2.). Consecinţa interacţiunii poate fi distrugerea moleculei ţintă, modificarea funcţiei acesteia sau formarea unui antigen. Deoarece ţintele moleculare care sunt afectate de substanţele toxice sunt esenţiale pentru viaţa sau buna funcţionare a celulelor, aceste interacţiuni se vor reflecta la nivel celular prin distrugerea structurii celulare sau prin modificarea funcţiei celulare. Aceste modificări sunt strâns corelate, o leziune celulară putând antrena un deficit funcţional, iar o alterare funcţională putând conduce la afectarea integrităţii structurale.

128 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

TIPURI DE REACTII Legare necovalenta Legare covalenta Sustragerea H Transfer de electroni Reactie enzimatica

CONSECINTE TOXIC FINAL

MOLECULA TINTA

Functie anormala Distrugere Formare de antigeni

CARACTERISTICI ALE TINTEI Reactivitate Accesibilitate Functie critica

Fig.6.2. Reacţia toxicului final cu molecula ţintă

I. AFECTAREA STRUCTURII CELULARE Acţiunea substanţelor toxice asupra structurii celulare poate conduce la: distrugere celulară totală (moartea celulei), sau doar la lezarea membranei celulare sau a organitelor celulare. MOARTEA CELULARĂ Moartea celulelor se poate produce prin două mecanisme: necroza şi apoptoza.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 129

1. Necroza este consecinţa acţiunii unor factori externi asupra celulei: căldură, anoxie, substanţe toxice, şi are următoarele caracteristici morfologice şi funcţionale: Ø Este un proces pasiv Ø Afectează de obicei mai multe celule individuale adiacente Ø Membrana plasmatică este pierdută în fazele incipiente ale morţii celulare Ø Se produce umflarea citoplasmei cu degenerarea organitelor celulare Ø Cromatina nucleară devine mai puţin densă Ø Conduce de obicei la inflamaţie exudativă datorită eliberării resturilor celulare în ţesutul adiacent Ø Are loc degenerarea celulei 2. Apoptoza este o formă de moarte celulară programată, care are rolul de a îndepărta celulele nedorite, deci de a menţine homeostazia normală a ţesuturilor. Apoptoza are următoarele caracteristici: Ø Moartea celulei nu se produce sub acţiunea directă a unor factori lezionali, dar stimulii externi pot induce în celula afectată procese metabolice care declanşează apoptoza Ø Este un proces activ Ø Afectează de obicei celule izolate dintr-un ţesut sau un organ Ø Are loc condensarea citoplasmei, structura organitelor celulare fiind puternic afectată Ø Se produce condensarea cromatinei nucleare Ø Nu este însoţită de inflamaţie Ø Se produce fragmentarea celulei, cu apariţia „corpilor apoptotici” În moartea celulară prin apoptoză sunt implicate nişte enzime specifice denumite caspaze, care sunt nişte proteaze intracelulare latente. Semnalul de moarte celulară determină clivajul pro-enzimei, formându-se caspaza activă tetramerică. Tiolii celulari, cum ar fi glutationul şi tioredoxina, favorizează activitatea caspazei inductibile. Celulele nedorite pot fi sensibilizate la moartea celulară de anumite substanţe nutritive oxidoreducătoare ca acidul α-lipoic. Acidul lipoic pătrunde în celulă şi este redus la acid dihidrolipoic, un reducător puternic ce poate regla activitatea caspazei inductibile. În anumite condiţii, speciile reactive de oxigen (ROS) şi speciile reactive de azot (RNS), pot inhiba funcţia caspazei inductibile, oprind executarea morţii celulare (Fig.6.3.). Deşi multă vreme s-a crezut că apoptoza nu este implicată în procesele de origine toxică, tot mai multe date susţin rolul stresului oxidativ în iniţierea apoptozei, iar stresul oxidativ la rândul său poate fi indus şi de substanţe toxice. Stresul oxidativ, aşa cum s-a văzut, poate fie promova, fie inhiba apoptoza, dependent de nivelul la care are loc lezarea.

130 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig.6.3. Reglarea redox a activităţii caspazei inductibile

Moartea celulelor se poate produce ca urmare a acţiunii caustice, sau ca urmare a legării ireversibile a unor intermediari reactivi. A) Acţiunea caustică Efectul caustic constă dintr-o arsură chimică, diferită de cea termică, produsă la locul de contact între substanţa toxică şi ţesut, care poate fi: pielea, mucoasele externe, digestive, respiratorii, rinichiul, nervul optic, etc. Agenţii caustici dezorganizează sau chiar distrug arhitectura celulară în urma denaturării proteinelor şi pot fi: - substanţe care creează un pH acid sau bazic diferit de cel fiziologic - substanţe oxidante - substanţe deshidratante - soluţiile unor cationi organici sau anorganici - anioni aromatici (acid salicilic) - detergenţi cationici. B) Formarea de intermediari reactivi Intermediarii reactivi sunt : structurile electrofile, radicalii liberi şi speciile reactive de oxigen. 1. Structurile electrofile se formează de obicei prin reacţii catalizate de izoenzimele citocromului P450 şi pot fi epoxizi, chinone sau ioni de nitreniu.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 131

2. Radicalii liberi sunt molecule sau fragmente moleculare care conţin unul sau mai mulţi electroni nepereche în orbitalul extern. Radicalii liberi se formează prin: § I. Acceptarea sau pierderea unui electron § II. Clivajul homolitic al unei duble legături I. a) Reducerea prin acceptarea unui electron, un mecanism prin care multe substanţe formează radicali liberi, este catalizată de NADPH citocrom P450 reductaza microzomială. Xenobiotice ca paraquatul (Fig.6.4.), doxorubicina, nitrofurantoina, acceptă un electron de la reductaze pentru a forma radicali. De obicei, aceşti radicali transferă electronul suplimentar oxigenului molecular, formând radicalul anion superoxid (O2 .-) şi regenerând compusul părinte, care este astfel disponibil pentru a câştiga un nou electron. Se iniţiază astfel un „ciclu redox”, în care o moleculă de xenobiotic acceptoare de electroni poate genera mai multe molecule de O2.-. Alternativ, radicalul xenobiotic cu un electron suplimentar poate reduce şi în consecinţă elibera Fe3+ din feritină, producând ioni Fe2+ care sunt toxici.

NADPH

citocrom P450 reductaza forma oxidata

NADP

citocrom P450 reductaza forma redusa

N

H3C

.

+

+

N

H3C

-

N

CH3

+ N

CH3

O2

O2

.-

e

Paraquat

Fig.6.4. Bioactivarea paraquatului

I. b) Pierderea unui electron. Xenobioticele nucleofile: fenoli, hidrochinone, aminofenoli, amine, hidrazine, fenotiazine, tioli, sunt susceptibile să piardă un electron într-o reacţie catalizată de peroxidaze, formând radicali liberi. Unele din aceste substanţe, de exemplu catecoli, hidrochinone, pot suferi o oxidare în două etape, producându-se întâi radicali semichinone, apoi chinone. Chinonele la rândul lor pot participa la cicluri redox, cu generarea de radical anion superoxid (Fig.6.5.). II. Formarea de radicali liberi prin clivajul homolitic al legăturii covalente (clivaj reducător): poate fi indus prin transferul electronului la moleculă. Acest mecanism este implicat în conversia CCl4 la radical triclormetil printr-un transfer de electroni

132 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

de la citocromul P450 sau de la lanţul mitocondrial de transport al electronilor (dehalogenare reducătoare) (Fig.6.6.).

Clx

Clx

O

CYP450, O2

Formare directa de aducti cu ADN

NADPH CYP450 O2 NADPH

OH Clx

OH

Clx CYP450, O2 NADPH HO OH

Cu(II) Peroxidaze

Clx OH Cu(I)

O

-

Clx

.

O O2

.-

Cu(I) + H2O2 + O2

.

-

O

HO + HO + Cu(II) Clx

ADN O

Formare directa de aducti cu ADN

Formare directa de aducti cu ADN (hidroxilare)

ADN

Formare directa de aducti cu ADN

Fig.6.5. Bioactivarea bifenililor policloruraţi (PCB)

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 133

.

CCl3

CCl4

P-450-Fe3+

P-450-Fe3+.......CCl4 -

e

-

Cl

.

P-450-Fe3+.......CCl3

Fig.6.6. Mecanismul posibil al dehalogenării tetraclorurii de carbon mediate de citocromul P450

3. Speciile reactive de oxigen. Numeroase substanţe toxice, pe lângă faptul că se pot transforma în radicali liberi în cursul metabolizării, pot participa la ciclurile redox, generând radical anion superoxid, care la rândul său determină formarea altor specii reactive de oxigen (ROS) implicate în numeroase procese citotoxice. Substanţele toxice care participă la „ciclurile redox” sunt de obicei chinone şi hidrochinone, iar ciclul redox începe cu o etapă de reducere care implică un singur electron şi care este catalizată de citocrom P450 reductaza NADPH dependentă. Speciile reactive de oxigen sunt prezentate în Tabelul VI.1. Generarea peroxidului de hidrogen are loc prin dismutaţia superoxidului. De aceea, orice sistem biologic care generează radical anion superoxid va produce peroxid de hidrogen. Există însă şi enzime localizate în peroxizomi care produc peroxid de hidrogen fără a necesita radicalul anion superoxid (O2.-) ca intermediar. Spre deosebire de O2.-, peroxidul de hidrogen este capabil să traverseze membranele, reacţionând în celulă cu Fe2+ sau Cu+ pentru a forma radicali hidroxil prin Reacţia Fenton (Fig.6.7.). Reacţia Fenton este catalizată de ioni ai metalelor tranziţionale, de obicei Fe(II) sau Cu(I), Cr(V), Ni (II) sau Mn(II), şi reprezintă un mecanism major al toxicităţii H2 O2 şi al precursorului său O2.-, precum şi al metalelor tranziţionale, deoarece radicalul hidroxil este unul dintre cei mai puternici şi mai reactivi oxidanţi cunoscuţi, reacţionând imediat cu orice compus biologic disponibil.

134 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Tabel VI.1. Specii reactive de oxigen Modul de formare Excitarea O2 Reducerea oxigenului prin adiţia unui electron; cicluri redox Protonarea radicalului anion superoxid Reducerea radicalului anion superoxid prin adiţia unui electron Din apă, sub acţiunea radiaţiilor ionizante şi din peroxidul de hidrogen, prin dezintegrare catalizată de metale Din O2, prin fotoliză

Specia reactivă de oxigen Oxigen singlet (1O2) Radical anion superoxid (O2.-) Radicalul perhidroxil (.O-OH) Anionul peroxid (O22-) Radicalul hidroxil (OH.)

Ozonul (O3)

Altă sursă de peroxid de hidrogen în afară de dismutaţia spontană sau cea catalizată de superoxiddismutază (SOD) a radicalului anion superoxid, este aceea de produs secundar, direct sau indirect, al mai multor reacţii catalizate de enzime ca: monoaminoxidaza, xantinoxidaza, acil-coA oxidaza. .-

O2 O2

O2 SOD

.-

HOOH 2H+

Fe(II), Cu(I), Mn(II), Cr(V), Ni(II)

Fe(III), Cu(II), Mn(III), Cr(VI), Ni(III)

.

HO

-

OH

Fig. 6.7. Reacţia Fenton

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 135

O altă reacţie ce permite formarea radicalului hidroxil este Reacţia HaberWeiss (Fig.6.8.), care este probabil catalizată de ionii de fier liberi (b), sau de fierul sechestrat în feritină, lactoferină, hemoglobină şi mioglobină. .-

-

+ H2O2

b)

O2

Fe3+

O2

Fe2+

.-

1

.

HO + OH + 1O2

a) O2

.

-

OH + HO

H2O2

Fig. 6.8. Reacţia Haber-Weiss

Mecanisme de apărare împotriva speciilor reactive de oxigen Organismul dispune de mecanisme care îi permit să se apere împotriva agresiunii speciilor reactive de oxigen. Ele pot fi mecanisme enzimatice sau mecanisme neenzimatice. Mecanismele enzimatice, alături de modul de generare a acestor compuşi reactivi, sunt prezentate în Fig.6.9. a) Mecanismele enzimatice sunt reprezentate de: Ø Superoxiddismutaze (SOD), proteine ce conţin metale şi care catalizează conversia radicalului anion superoxid la oxigen molecular şi peroxid de hidrogen: a) O2.- + SOD-Cu2+ b) O2.- + SOD-Cu+ + 2H+

O2 + SOD-Cu+ H2O2 + SOD-Cu2+

Ø Catalaza (CAT), o enzimă ce conţine hem şi care transformă peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen. Ea acţionează numai asupra peroxidului de hidrogen, nu şi asupra peroxizilor organici. Se găseşte în majoritatea ţesuturilor, în peroxizomi. Ø Glutation peroxidaza (GPX) catalizează şi conversia peroxizilor organici (ex. hidroperoxizii lipidici). Enzima este specifică pentru glutation, nu pentru substraturile detoxifiate. Se găseşte în majoritatea ţesuturilor, atât în citosol cât şi în mitocondrii.

136 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

b) Mecanismele neenzimatice constau în reacţia radicalilor cu substanţe care îi inactivează. Astfel de substanţe sunt: Ø Vitamina E: lipofilă, încorporată în membrane Ø Vitamina C: hidrosolubilă, se găseşte în citosol.

RE

PEROXIZOMI

GSSG

GR P450 oxidaza

H2O O2

oxidaze GPX

GSH NADPH oxidaza

O2

H2O2 H2O

.-

NADP+

NADPH

CAT

Cu,Zn-SOD

O2.-

O2

H+

O2 dismutatie MPO spontana

xantin oxidaza

1

O2

2+

+

Fe /Cu

. .-

O2

3+

lantul mitocondrial -

de transport al e

.O2

Mn-SOD

H2O2

2+

Fe /Cu

O2

O2

OH

GPX

H2O

CAT

O2

Fig. 6.9. Generarea speciilor reactive de oxigen şi principalele mecanisme enzimatice de apărare

4. Speciile reactive de azot. O altă specie reactivă care poate induce leziuni ale acizilor nucleici este oxidul nitric, mai ales în prezenţa superoxidului, cu care formează specii secundare mai reactive. Speciile secundare pot reacţiona la rândul lor cu alţi constituenţi celulari formând specii terţiare, care pot de asemenea leza ADN-ul (Fig.6.10.).

2NO + O2

2NO2

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 137

NO2 + NO

N 2 O3

Anhidrida nitroasă este mai reactivă şi mai susceptibilă să producă leziuni decât oxidul nitric. N2O3 + amine → nitrozamine + tioli → nitrozotioli N2O3 + H2O2 → 2HNO2 NO + O2- → ONOO(peroxid) (peroxinitrit) Reacţia este mai eficientă decât cea a superoxidului cu superoxid dismutaza. Candidaţii majori la lezarea ADN-ului sunt: anhidrida nitroasă şi peroxinitritul. Donori de oxid nitric sunt: nitrozureele – ex. streptozocina nitroglicerina Oxidul nitric se mai găseşte şi în atmosferă, unde provine din gazele de eşapament ale automobilelor sau din fumul de ţigară.

SPECII SECUNDARE

N2 O 3

-

+O2

NITROZAMINE ADUCTI AI GLUCOZEI

+O2 OXID NITRIC

SPECII TERTIARE

ONOO

NITOZOTIOLI

LEZARE ADN

Fig. 6.10. Acţiunea oxidului nitric ca mutagen primar, secundar sau terţiar

138 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Implicaţiile toxicologice ale interacţiunii intermediarilor reactivi cu ţintele moleculare Acestea constau în: Ø Legarea covalentă de ţintele moleculare Ø Peroxidarea lipidelor Ø Inducerea stresului oxidativ 1. Legarea covalentă de ţintele moleculare (acizi nucleici, proteine, cofactori, lipide) poate avea drept consecinţe: - scăderea producerii de energie - modificarea permeabilităţii membranei - inhibarea sintezei de macromolecule - inhibarea unor enzime - mutageneză, carcinogeneză 2. Peroxidarea lipidelor Este un proces iniţiat de atacul speciilor reactive de oxigen (radical hidroxil, oxigen singlet) asupra acizilor graşi polinesaturaţi din componenţa membranelor biologice, care poate duce la lezarea acestora şi în final la moarte celulară. Procesul decurge în 3 etape (Fig.6.11.): I. sustragerea de către radicalul hidroxil sau oxigenul singlet a unui atom de hidrogen de pe catena unui acid gras nesaturat, la nivelul întâlnirii a două grupări alil. (iniţiere = formarea radicalului) II. reacţia radicalului acidului gras format cu oxigenul molecular (peroxidare) III. oprirea reacţiei în lanţ (terminare) 3. Stresul oxidativ Este situaţia în care producerea speciilor reactive de oxigen depăşeşte eliminarea lor prin sistemul antioxidant natural de apărare, sau când acesta din urmă este afectat, în organism existând o interacţiune continuă cu agenţi oxidanţi. În această situaţie se utilizează mai mulţi echivalenţi reducători decât ar fi cazul pentru funcţionarea normală a celulei. Echivalenţii reducători depozitaţi în celule sunt NADPH-ul, glutationul, proteinele cu grupări tiol, vitaminele C şi E. Cauzele principale ale stresului oxidativ sunt speciile reactive de oxigen şi structurile chinoidice. Există tot mai multe dovezi care vin în sprijinul ipotezei implicării stresului oxidativ în inducerea unor boli neurodegenerative, moartea celulară producându-se prin apoptoză indusă de speciile reactive de oxigen. Boli neurodegenerative în care

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 139 I. initierea

.

.

L + H2O

LH + OH

II. propagarea

.

.

L + O2

LOO

LH

LOOH III. terminarea

.

L + L

.

. .

L + LO2

.

produsi lipsiti de activitate

.

LO2 + LO2

LH . = acid gras polinesaturat L = radical lipidic

Fig.6.11. Etapele peroxidării lipidelor

există date cu privire la implicarea stresului oxidativ sunt : Boala Alzheimer, Boala Parkinson, Boala Hungtington, scleroza laterală, diskinezia tardivă indusă de neuroleptice, tulburările neurologice induse de substanţe toxice ca metilmercurul, cadmiul, toluenul, solvenţii organici.

II. TULBURĂRI ALE FUNCŢIEI CELULARE INDUSE DE SUBSTANŢELE TOXICE Tulburările induse de substanţele toxice la acest nivel depind de rolul moleculei ţintă în funcţionarea celulei. Astfel, dacă molecula ţintă este implicată în reglarea funcţiei celulare, afectarea ei poate conduce la disfuncţii ale exprimării genice sau la disfuncţii ale activităţii celulare în desfăşurare. Dacă molecula ţintă este implicată în homeostazia celulară, afectarea ei poate compromite supravieţuirea celulei.

140 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

1. Disfuncţii ale exprimării genice Acestea se pot produce la nivelul: - elementelor responsabile de transcripţie - componentelor căii de transducţie a semnalelor - sintezei, depozitării sau eliberării moleculelor de semnalizare: hormoni, citokine, factori de creştere, neuromeditori, oxid nitric. Disfuncţii la nivelul transducţiei semnalelor Celulele individuale dintr-un organism multicelular trebuie să comunice între ele pentru a coordona funcţia diferitelor ţesuturi şi sisteme de organe. Comunicarea intercelulară constă în secreţia de către o celulă a unei molecule care se leagă apoi de receptorii unei a doua celule, inducând o modificare a activităţii biologice a acesteia. Mecanismul prin care legarea unei molecule de receptorul său din celula ţintă induce o modificare a activităţii biologice a acesteia din urmă poartă denumirea de transducţie a semnalelor. Moleculele de semnalizare, hormonii sau neuromediatorii, nu pătrund în celulele cărora le este adresat mesajul pe care îl transportă. Mesajele sunt comunicate prin membrana plasmatică prin intermediul unor proteine receptoare integrate membranei, care pot fi receptori cuplaţi cu proteine G, receptori cuplaţi cu canale ionice sau receptori cuplaţi cu enzime cum sunt tirozin kinazele. Legarea moleculei de semnalizare de receptor va determina eliberarea în citosolul celulei a unor molecule numite mesageri secundari, care transferă la rândul lor semnalele unor enzime sau altor proteine din celulă, cum ar fi protein kinazele. Principalii mesageri secundari din celule sunt inozitol trifosfatul (IP3 ), 3’,5’-adenozin monofosfatul ciclic (cAMP) şi guanin monofosfatul ciclic (cGMP). Perturbarea transducţiei semnalelor indusă de substanţele toxice este probabil responsabilă de modificarea exprimării genice după expunerea celulelor la stres oxidativ, la metale grele şi la compuşi ce formează aducţi prin legături covalente. De exemplu, s-a dovedit că mecanismul de producere a neurotoxicităţii plumbului poate fi explicat prin interferarea în transducţia semnalelor. Plumbul poate mima acţiunea calciului sau îi poate perturba homeostazia, calciul fiind un cofactor în multe procese celulare implicate în transducţia semnalelor. Astfel, plumbul poate activa protein kinaza C (PKC) şi o poate transloca din citosol în membrane, fiind chiar mai activ decât calciul. Datorită activării susţinute a enzimei, se poate produce un fenomen de reglare negativă, care în final determină scăderea activităţii PKC. Această scădere a activităţii a fost corelată cu deficitul de memorie şi cu scăderea capacităţii de învăţare care sunt observate la persoanele expuse cronic la plumb.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 141

2. Disfuncţii ale activităţii celulare în desfăşurare Celulele cele mai afectate sunt celulele excitabile, cum ar fi neuronii şi celulele musculare din muşchii scheletici, cardiac şi netezi. Funcţiile acestor celule, ca eliberarea neuromediatorilor şi contracţia musculară, sunt controlate de transmiţători şi de modulatori care sunt sintetizaţi şi eliberaţi de celulele adiacente. Substanţele toxice pot perturba funcţia acestor celule prin alterarea: - nivelelor de neuromediatori - funcţiei receptorului (legare de receptori) - procesului de transducţie a semnalelor - procesului de întrerupere a semnalului Prin acest mecanism de acţiune se explică toxicitatea unor medicamente, pesticide sau toxine din bacterii, plante şi animale. 3. Afectarea homeostaziei celulare 3.1. Decuplarea fosforilării oxidative Necesarul energetic al organismului este asigurat de oxidarea glucidelor şi lipidelor, cuplată cu sinteza adenozin trifosfatului (ATP) prin fosforilare oxidativă. Energia chimică este eliberată prin hidroliza ATP la ADP sau AMP. ADP este refosforilat în mitocondrie de către enzima ATP-sintetază. Acest proces este cuplat cu oxidarea hidrogenului la apă, necesitând oxigen (Fig.6.12.). În reducerea oxigenului la apă intervine un sistem de transport al electronilor, care constă dintr-o serie de reacţii redox. Substanţele toxice care interferează în sinteza mitocondrială a ATP au fost împărţite în patru clase: Ø I) Substanţe care interferează în furnizarea hidrogenului către lanţul de transport al electronilor. Un exemplu este fluoroacetatul, care se formează în locul acetatului în intoxicaţiile cu fluoruri şi care inhibă ciclul acidului citric şi producerea de cofactori reduşi. Ø II) Substanţe care inhibă transferul electronilor către oxigen de-a lungul lanţului de transport, cum este cazul cianurii. Ø III) Substanţe care afectează eliberarea oxigenului către citocrom oxidază, transportorul ultim al electronilor. Toate substanţele toxice care produc hipoxie acţionează în final în acest mod. Ø IV) Substanţe care inhibă activitatea ATP-sintetazei sau sinteza ATP-ului la acest nivel, cum ar fi DDT-ul, pesticidele dinitrofenolice, salicilaţii.

142 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Substraturi Produsi GLUCOZA

ACIZI GRASI

O2

ATP

Pi ADP 2H2O

acizi grasi-CoA

piruvat

AP βOX

PDH acetil-CoA CICLUL ACIDULUI CITRIC

NAD+

NADH + H+

-

-

H+

e

LTE

Inhibitori

I

II

O24

4H+

SY

III

IV

Fig.6.12. Fosforilarea oxidativă în mitocondrii (AP = transportorul ATP, ADP, LTE = lanţul de transport al electronilor, SY = ATP sintetaza, Pi = fosfat anorganic, βOx = β-oxidarea acizilor graşi)

3.2. Afectarea homeostaziei calciului Ionii de calciu au un rol foarte important în funcţionarea celulelor, iar nivelele şi localizarea lor sunt strict controlate de procese de compartimentare şi de mecanisme de transport. Diferite substanţe toxice pot perturba aceste mecanisme, producând efecte dăunătoare grave la nivel celular. Creşterea concentraţiilor intracelulare ale calciului liber poate produce modificări ale citoscheletului, umflarea şi în final perforarea membranei plasmatice, afectarea funcţiei mitocondriale şi activarea unor enzime de degradare dependente de calciu (proteaze, fosfolipaze, endonucleaze). Substanţele toxice pot creşte concentraţia intracelulară a calciului fie prin favorizarea pătrunderii în celulă (substanţe care acţionează prin intermediul unor

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 143

receptori citosolici care cresc sinteza proteinelor), fie prin impedimentarea transportului calciului. Prin acest ultim mecanism acţionează majoritatea compuşilor chimici care induc leziuni oxidative, cum ar fi radicalii liberi, chinonele şi peroxizii.

GENOTOXICITATEA Genotoxicitatea reprezintă efectul substanţelor toxice asupra materialului genetic. Acesta este alcătuit din acizii nucleici, acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi acidul ribonucleic (ARN). ADN-ul este o macromoleculă gigantică, a cărei structură permite stocarea exactă a unei mari cantităţi de informaţii. Codul genetic este compus din patru „litere”: două baze azotate pirimidinice (timina şi citozina) şi două baze purinice (guanina şi adenina), care sunt aranjate în codoni, sau tripleţi, fiecare codon constând dintr-o combinaţie de trei litere. Molecula de ADN este alcătuită din două catene, bazele de pe o catenă fiind legate între ele printr-un schelet de fosfat dezoxiriboză. Cele două catene sunt legate prin intermediul legăturilor de hidrogen stabilite între baze. Adenina de pe o catenă este întotdeauna legată de timina de pe catena soră, iar guanina de citozină. Molecula dublu catenară de ADN are proprietatea unică de a realiza copii identice, în prezenţa precursorilor, enzimelor corespunzătoare şi a cofactorilor. Aceasta presupune separarea celor două catene prin ruperea legăturilor de hidrogen, urmată de împerecherea unităţilor de dezoxiribonucleotid trifosfat sub acţiunea ADN polimerazei, în procesul de replicaţie. Un alt proces în care este implicat ADN-ul este transcripţia, care presupune sinteza unei molecule de ARN mesager pornind de la ADN, sub acţiunea enzimei ARN polimerază. ARN-ul mesager este monocatenar şi este constituit din uracil în loc de timină, şi riboză în loc de dezoxiriboză. ARN-ul mesager are rolul de a transmite informaţia de la ADN la maşina de sinteză a proteinelor, acţionând ca o copie cu durată scurtă de viaţă a genelor exprimate. În continuare are loc translaţia moleculelor de ARN mesager în polipeptide, proces care implică intervenţia ARNului de transfer şi a ARN-ului ribozomal. Mutageneza reprezintă inducerea unor leziuni ale ADN-ului, sau a altor alterări genetice care se manifestă sub forma mutaţiilor. Mutaţiile sunt modificări ereditare ale materialului genetic, care determină schimbări ereditare de la o celulă la alta între celulele somatice, sau de la un organism la descendenţi, atunci când sunt afectate celulele germinale. Mutaţiile pot fi clasificate în: - 1) Mutaţii genice, când se modifică prin pierdere, deleţie sau transformare, o singură pereche de baze

144 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

- 2) Aberaţii cromozomiale, când se produc modificări majore ale structurii cromozomilor, sau ale numărului de cromozomi. 1) Mutaţiile genice se mai numesc şi mutaţii punctuale, deoarece implică transformarea unei singure perechi de baze. Ele sunt invizibile în microscopia clasică şi pot fi detectate doar pe baza unor modificări fenotipice. Se pot datora substituţiei unor perechi de baze sau adiţiei sau deleţiei unor perechi de baze. a) Substituţia unei perechi de baze poate fi o: - tranziţie, atunci când o bază purinică este înlocuită cu o altă bază purinică, sau o bază pirimidinică cu o bază pirimidinică - transversie, când o purină este înlocuită cu o pirimidină Mutaţiile punctiforme se pot produce prin trei mecanisme: Ø Transformarea chimică a bazelor, de exemplu sub acţiunea acidului azotos, care este capabil să transforme citozina în uracil sau adenina în hipoxantină (Fig.6.13.):

NH2

N

O

O

HN

HNO2 N

dezoxiriboza

N

O

dezoxiriboza

Fig.6.13. Deaminarea citidinei la uridină

Ø Încorporarea unor analogi anormali ai bazelor. Majoritatea substanţelor toxice care acţionează în acest mod sunt din clasa citostaticelor, care îşi datorează eficienţa capacităţii lor de a induce mutaţii letale în celulele canceroase cu diviziune rapidă (Fig.6.14.). Exemple de astfel de compuşi sunt: 2-aminopurina, 6-mercaptopurina.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 145

Bu

C-G A-T G-C

G-C Bu - G Bu - A

G-C Bu - A Bu - A

C-G A - Bu G - Bu

C-G A-T A-T Fig.6.14. Replicarea unui acid nucleic în prezenţa analogului bromouracil (Analogul va forma perechi de baze atât cu adenina cât şi cu guanina, rezultatul fiind o tranziţie G – C la A – T)

Ø Acţiunea agenţilor alchilanţi. Agenţii alchilanţi sunt substanţe chimice care pot introduce o grupare alchil în molecula ADN-ului. Ei conţin ioni pozitivi de carboniu (ex. CH3 +), care se combină cu bazele azotate bogate în electroni din ADN. Un exemplu de reacţie de alchilare cu semnificaţie toxicologică este acela al dimetilnitrozaminei (Fig.6.15.).

H3C

H3C N

H3C

N

O

N HOH2C

N

O

- HCHO

H3C N

N

O

H

CH3N2OH

LEGARE DE ADN

Fig.6.15. Generarea unui agent de metilare din dimetilnitrozamină

Pentru alchilare sunt disponibile mai multe poziţii ale bazelor purinice şi pirimidinice (Fig.6.16.), şi de asemenea şi grupările fosfat din ADN pot fi alchilate.

146 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

6 O

NH2 N 7

1 N

N

3 N

H

N 7

N

H2N

3

Adenina

N

N

Guanina

4 O

NH2 H 3 N

O 2

N

O 2

N

CH3

N

3

Citozina

Timina

Fig.6.16. Poziţiile de alchilare a ADN-ului în condiţii fiziologice

b) Adiţia sau deleţia unei baze determină modificarea grilei de lectură a codului genetic (Fig.6.17.) şi are consecinţe mai drastice deoarece, după locul mutaţiei, fiecare triplet din ARN-ul mesager este modificat.

ACA* AAG AGU CCA

ACA AGA GUC

UCA

CAU CA

Fig.6.17. Modificarea grilei de lectură prin deleţia bazei A*

1) Aberaţiile cromozomiale constau în modificări majore ale cromozomilor, care pot fi detectate în microscopia clasică, prin examinarea cromozomilor în metafază. Substanţele care produc aberaţii cromozomiale poartă

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 147

denumirea de substanţe clastogene. Aceste mutaţii se datorează unor rupturi, deleţii, modificări şi rearanjări ale materialului cromozomial în cursul ciclului celular, unele din ele fiind letale pentru celulă. Sunt de două tipuri: a) de tip cromatidă, când o singură cromatidă prezintă aberaţii, sau b) de tip cromozom, când ambele cromatide sunt afectate. Majoritatea agenţilor chimici clastogeni produc aberaţii de tip cromatidă. • Aberaţiile numerice, care constau în modificarea numărului de cromozomi, sunt consecinţa diviziunii inegale a cromozomilor şi conduc la formarea unor celule ce au fie mai mulţi, fie mai puţini cromozomi decât normal. Aneuploidia constă în câştigarea sau pierderea unuia sau a câtorva cromozomi şi se întâlneşte în unele boli genetice cum ar fi sindromul Down (mongolism), care este asociat cu trisomia cromozomului 21. Poliploidia constă în prezenţa în celule a unui multiplu al echipamentului cromozomial complet. Substanţe chimice care produc poliploidie sunt colchicina, vincristinul, vinblastinul. TESTE DE MUTAGENEZA Pentru evaluarea potenţialului mutagen al substanţelor se folosesc teste de mutageneză. La ora actuală sunt disponibile peste 100 de teste, atât in vivo cât şi in vitro, care se realizează pe diferite organisme: - teste in vitro: pe bacterii, culturi de celule de mamifere şi culturi de celule umane - teste in vivo: pe Drosophila, mamifere, organisme umane Deoarece multe substanţe acţionează ca mutageni numai după bioactivare şi transformare în metaboliţi electrofili foarte reactivi, iar multe teste de mutageneză se efectuează in vitro, pentru mimarea metabolizării se utilizează o fracţiune a ficatului de şobolan, S9. S9 este supernatantul obţinut după centrifugarea timp de 20 de minute la 9000g a unui omogenat de ficat de şobolan şi conţine sistemele enzimatice implicate în metabolizarea xenobioticelor (OFMM). Deoarece enzimele de origine microzomală sunt inductibile, se preferă utilizarea unui omogenat de ficat care provine de la animale tratate în prealabil cu inductori enzimatici (bifenili policloruraţi, 3-metil colantren, fenobarbital). După tipul de efect asupra materialului genetic pe care îl evidenţiază, testele de mutageneză se clasifică în: A) Teste care măsoară mutaţiile genice 1) Teste microbiene in vitro Deoarece mutaţiile de acest tip nu sunt vizibile la microscop, aceste teste se bazează pe utilizarea de variante biologice cu un caracter specific, sau pe

148 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

producerea de mutaţii letale recesive. Mutaţiile la nivelul unui situs specific se pot produce în 2 sensuri: Ø În sensul direct: de la un tip sălbatec la un tip mutant; mutaţiile sunt puse în evidenţă prin rezistenţa lor la un agent toxic, care traduce modificarea unei enzime Ø În sens revers: de la tipul mutant la tipul sălbatec de origine. Se utilizează suşe „auxotrofe”, care necesită deci un factor de creştere şi care pierd această cerinţă prin mutaţie, redevenind „prototrofe”, deci capabile să crească pe un mediu lipsit de acest factor de creştere. Un exemplu clasic este Testul Ames, care măsoară reversia mutantelor histidin-dependente de Salmonella typhimurium la tipul sălbatec, histidinindependent. Se incubează suşele mutante cu substanţa de testat într-un mediu de cultură sărac în histidină, care nu permite deci dezvoltarea mutantelor. Dacă substanţa produce mutaţii reverse, se formează suşe histidin-independente, care se pot dezvolta pe mediul sărac în histidină şi pe placă se observă coloniile bacteriene. 2) Teste pe celule de mamifere Se folosesc celule de limfom de şoarece, limfoblaşti umani, celule de plămân sau ovar de hamster chinezesc. De exemplu, se pot folosi linii celulare de fibroblaşti de ovar de hamster chinezesc femelă sau linii celulare de fibroblaşti de plămân de hamster chinezesc mascul. Aceste două linii celulare au avantajul de a avea un nivel redus de mutaţii spontane, iar cariotipul lor este bine definit. Celulele prezintă locusul HPRT, care codifică enzima hipoxantin-guanin-fosforibozil transferaza, ce intervine în fosforilarea guaninei. Celulele care vor prezenta o mutaţie la nivelul locusului HPRT îşi vor pierde activitatea enzimatică, sau aceasta va fi redusă, deci din 6-tioguanină nu se va sintetiza o nucleotidă letală, iar colonia se va dezvolta. Testul constă în măsurarea numărului de colonii rezistente la 6tioguanină în prezenţa şi în absenţa agenţilor mutageni. 3) Teste microbiene in vivo 4) Teste ce utilizează insecte Se foloseşte musca Drosophila melanogaster deoarece: - este bine caracterizată din punct de vedere genetic - metabolizează substanţele toxice asemănător cu mamiferele - timpul de producere a unei generaţii este doar de 12-14 zile 5) Teste ce evidenţiază mutaţii genice la şoareci B) Teste care detectează mutaţiile cromozomiale 1) Teste pe insecte 2) Studii citogenetice pe celule de mamifere: pot fi teste in vitro sau teste in vivo.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 149

Teste in vitro: Se utilizează celule de limfom de şoarece, ovar de hamster chinezesc sau limfocite umane. Substanţa se testează paralel cu doi martori pozitivi cu activitate mutagenă cunoscută, unul care acţionează direct (sulfonat de etilmetan) iar altul care acţionează după bioactivare (dimetilnitrozamină). După o perioadă de incubare corespunzătoare, diviziunea celulară este oprită prin adăugare de colchicină, celulele sunt preparate şi se evaluează anomaliile care apar la nivelul cromatidelor sau cromozomilor. Teste in vivo: Testul micronucleilor se efectuează pe măduvă hematogenă de şoarece şi se bazează pe evidenţierea unor formaţiuni citoplasmatice rotunde, asemănătoare ca formă, structură şi proprietăţi tinctoriale cu nucleul, motiv pentru care au fost denumite micronuclei. Între formarea micronucleilor şi aberaţiile cromozomiale există o strânsă legătură, deoarece ei pot lua naştere fie din fragmente cromozomiale acentrice, care în anafază nu se mai pot deplasa spre nucleii în formare, fie din cromozomi întregi, care nu mai sunt incluşi în nucleii fii datorită retardării anafazice produse prin lezionarea aparatului mitotic. 3) Testul letalităţii dominante la rozătoare Evidenţiază efectele toxice asupra celulelor germinale ale masculilor sănătoşi (şoareci sau şobolani). Efectele se pot manifesta sub forma unor implantaţii care nu sunt viabile, sau sub forma pierderii pre-implantaţiilor la femelele fecundate de masculii trataţi. C) Teste care detectează repararea şi recombinarea ADN-ului 1) Sinteza neprogramată a ADN-ului Indică o reparare a ADN-ului care este definită prin cantitatea de timidină radioactivă încorporată per unitatea de greutate de ADN, în raport cu valorile determinate la martori. 2) Schimbul între cromatidele surori Măsoară schimbul reciproc de ADN între două cromatide surori ale unui cromozom în timpul duplicaţiei. Celulele sunt marcate cu 5-BRDU (5-bromodezoxi-uridină). După două cicluri de replicare, celulele sunt colorate şi se analizează şi compară frecvenţa schimburilor per celulă şi per cromozom. Celulele folosite pot fi limfom de şoarece, ovar de hamster chinezesc, limfocite umane. Nici unul din testele cunoscute nu prezintă fiabilitate totală, nefiind capabil să detecteze toate tipurile de mutaţii. De aceea, se preferă utilizarea mai multor teste din categorii diferite, care sunt grupate în baterii de teste. Testele de mutageneză sunt împărţite în 3 niveluri:

150 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Nivelul unu Ø 1) un test de mutaţie genică la Salmonella/ microzomi (Ames + activare) Ø 2) un test de mutaţie genică pe celule de mamifere Ø 3) un test care evidenţiază rupturi cromozomiale pe celule de mamifere (testul micronucleilor) Dacă toate testele sunt negative, se presupune absenţa potenţialului mutagen la mamifere. Nivelul doi: se realizează dacă este pozitiv un singur test din nivelul 1, cu ajutorul testului mutaţiei letale la Drosophila Nivelul trei: pentru evaluarea aprofundată a compuşilor care ridică semne de întrebare: Ø Testul locusului specific (test de mutaţie genică la şoarece) pentru produşii care posedă potenţial mutagen pe celule germinale de mamifere Ø Testul letalităţii dominante pentru produşii cu efecte cromozomiale.

CARCINOGENEZA CHIMICĂ Carcinogeneza este un proces în mai multe etape care se produce prin mai multe mecanisme incomplet elucidate şi care conduce la apariţia cancerului, un tip special de leziune a bolii denumite neoplazie. Neoplazia, sau leziunea sa constitutivă – neoplasmul sau tumoarea, reprezintă o creştere anormală a unui ţesut, care este ereditară şi relativ autonomă. Prin definiţie, neoplazia nu poate să apară decât în organismele multicelulare, iar caracterul ereditar se poate manifesta la nivelul celulelor somatice, de la o celulă la alta, sau la nivelul celulelor germinale, de la un organism la altul. Neoplasmele se clasifică în: - Neoplasme benigne, care sunt clar delimitate, adesea încapsulate, bine diferenţiate şi neinvazive. Creşterea lor este relativ scăzută, modificarea organizării celulare este redusă şi nu formează metastaze. - Neoplasme maligne, care sunt mai puţin bine definite şi de obicei mai puţin încapsulate. Ele sunt relativ nediferenţiate, creşterea lor este rapidă şi sunt invazive, formând în final metastaze. Metastaza reprezintă diseminarea sau creşterea secundară a neoplasmului la distanţă de tumoarea primară. Cancerele sunt neoplasme maligne. Nomenclatura neoplasmelor depinde de caracterul benign sau malign al neoplasmului, iar în ultimul caz de tipul de ţesut, epitelial sau mezenchimal, din care acestea derivă. De exemplu:

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 151

- pentru neoplasmele benigne, denumirea se formează din denumirea ţesutului de origine + sufixul „om”: fibrom, lipom, iar pentru neoplasmele de origine glandulară + prefixul „adenom”: adenom hepatocelular, adenom pituitar. - pentru neoplasmele maligne o A) derivate din ţesutul mezenchimal, denumirea se formează din denumirea ţesutului descriptor + sufixul „sarcom”: fibrosarcom, osteosarcom o B) derivate din ţesutul epitelial, denumirea se formează din cea a ţesutului descriptor + „carcinom”: carcinom hepatocelular, adenocarcinom gastric. Carcinogeneza chimică reprezintă inducerea sau creşterea frecvenţei leziunilor neoplazice sub acţiunea compuşilor chimici, iar carcinogenul este un agent care induce neoplazie.

PATOGENEZA CANCERULUI Carcinogeneza este un proces în mai multe etape, care este influenţat în mare măsură de variabile cum ar fi vârsta, dieta, balanţa hormonală, specia animală şi rasa. S-a constatat de asemenea că există o anumită predispoziţie genetică pentru anumite tipuri de cancere, ceea ce sugerează faptul că neoplazia ar rezulta dintr-o mutaţie recesivă ereditară a ADN-ului. Procesul carcinogenic poate fi divizat în două secvenţe (Fig.6.18.) şi anume transformarea neoplazică şi dezvoltarea neoplazică. Prima secvenţă de evenimente a fost denumită iniţiere. 1. Iniţierea este prima etapă a unui proces carcinogen şi constă în transformarea unei celule normale într-o celulă iniţiată prin apariţia unor defecte genetice. Defectele genetice constau în mutaţii de tipul împerecherii defectuoase a bazelor, deleţiilor sau translocaţiilor, şi se produc în urma acţiunii carcinogenului genotoxic, sau iniţiator, asupra moleculei de ADN. Celula rezultată, în care carcinogenul a indus o mutaţie, poate evolua în mai multe direcţii (Fig.6.19.): - a) repararea ADN-ului, când legătura covalentă cu iniţiatorul este distrusă şi populaţia celulară rămâne normală - b) eliminarea celulelor modificate prin procesul de apoptoză - c) legătura covalentă se păstrează, dar la nivelul unor locuri de legare în ADN care nu sunt importante pentru iniţierea unei tumori - d) celula iniţiată intră într-un proces de replicare şi mutaţia este „fixată”

152 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Secventele carcinogenezei Transformarea neoplazica

celula neoplazica

celula normala Initiere modificari ale ADN

aducti cu ADN efecte epigenetice replicarea celulei

celula preneoplazica

Transformare modificare genetica

Dezvoltarea neoplazica

activarea oncogenelor inactivarea genelor supresoare de tumori replicarea celulelor reducerea apoptozei

celula neoplazica

Promovare expansiune clonala

replicarea celulelor

neoplasm benign

Progresie modificare genetica heterogenitate

replicarea celulelor reducerea apoptozei neoangiogeneza

neoplasm malign

Fig.6.18. Secvenţele carcinogenezei

Deşi numărul de gene din ADN este foarte mare, doar un număr redus de gene celulare reprezintă ţinte ale modificărilor genetice ce pot iniţia transformarea neoplazică. Acestea sunt proto-oncogenele şi genele supresoare de tumori. Mutaţia proto-oncogenelor. Proto-oncogenele sunt gene care codifică proteine cu rol în stimularea progresiei celulare în cursul ciclului celular. Produşii codificaţi sunt: - 1) factori de creştere - 2) receptori ai factorilor de creştere - 3) transductori ai semnalelor intracelulare, cum ar fi proteinele G şi protein kinazele - 4) factori de transcripţie nucleară. Creşteri tranzitorii ale activităţii proteinelor codificate de proto-oncogene sunt necesare pentru reglarea creşterii în cursul embriogenezei sau a regenerării tisulare. Gena mutantă rezultată în urma acţiunii carcinogenului poartă denumirea de oncogenă şi codifică o proteină mutantă, care prezintă o creştere a activităţii ce poate iniţia transformarea neoplazică a celulei. Mutaţii ale genelor supresoare de tumori. Genele supresoare de tumori codifică proteine care inhibă progresia celulelor în cursul diviziunii celulare. Gena

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 153

mutantă codifică o proteină inactivă, care nu mai poate suprima diviziunea celulară şi în acest caz apare o proliferare necontrolată a celulelor. Cea mai cunoscută genă supresoare de tumori este gena p53, care codifică o proteină cu masa moleculară de 53000 daltoni. Această proteină poate opri diviziunea celulară in faza G1 permiţând repararea ADN-ului şi de asemenea promovează apoptoza, împiedicând acumularea de erori genetice şi procesul care duce la transformarea neoplazică.

CA RC IN O G E N G E N O T O XIC S U P R A V I E T U I R E A C E L U L E I

lez a r ea A D N

M O A R T E A

rep a ra r e rep lica r ea A D N

C E L U L E I

rep a ra r e M u ta tie silen tio a sa

A ctiv a re a p ro te in elo r o n c o g e n e

In a ctiv a rea p r o te in e lo r su p re so a r e d e tu m o ri

T R A N SF O R M A R E A N E O P L A ZIC A A C E LU L E I

e xp a n s iu n e c lo n a la TUM O ARE

Fig.6.19. Procesul carcinogenezei

Acumularea de leziuni genetice sub forma proto-oncogenelor mutante (care codifică proteine activate) şi a genelor supresoare de tumori mutante (care codifică proteine inactive) este principala cauză a transformării celulelor normale, cu o proliferare controlată, în celule maligne, cu o proliferare necontrolată. Deoarece

154 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

numărul de celule din ţesut este controlat de balanţa dintre mitoză şi apoptoză, proliferarea necontrolată rezultă din perturbarea acestei balanţe (Fig.6.20.). SUBSTANTA TOXICA formarea de aducti esecul repararii replicare transcriptie PROTEINA PROTOONCOGENA

translatie

transcriptie

reparare gresita PROTOONCOGENA

MUTATIE

ONCOGENA

PROTEINA translatie ONCOGENA

(activata de semnal)

-

+

APOPTOZA

MITOZA

PROLIFERARE NECONTROLATA

PROLIFERARE CONTROLATA

(activata permanent)

-

+

-

+

-

+

APOPTOZA

MITOZA

-

+

PROTEINA SUPRESOARE DE TUMORI (activa)

translatie

GENA SUPRESOARE DE TUMORI

transcriptie

MUTATIE

PROTEINA SUPRESOARE DE TUMORI translatie MUTANTA (inactiva) transcriptie

GENA SUPRESOARE DE TUMORI MUTANTA

reparare gresita replicare esecul repararii formarea de aducti SUBSTANTA TOXICA

Fig.6.20. Cooperarea între o proto-oncogenă şi o genă supresoare de tumori înainte şi după mutaţie

Modificările produse de iniţiator pot fi latente săptămâni sau luni şi sunt considerate ireversibile. O celulă care a suferit o modificare ireversibilă, ce îi permite transformarea neoplazică, poate fi imposibil de distins din punct de vedere fenotipic de celulele parenchimului normal adiacent. Se crede că majoritatea neoplasmelor derivă din proliferarea clonală a unei singure celule iniţiate. La un anumit moment în expansiunea clonală precoce, celulele devin diferite din punct de vedere fenotipic de celulele parenchimului normal înconjurător. Deşi astfel de

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 155

leziuni nu au încă suficiente caracteristici pentru a fi calificate drept neoplasme, ele sunt considerate drept celule pre-neoplazice. 2. Promovarea este etapa procesului carcinogen în care are loc selecţia şi expansiunea clonală a celulelor iniţiate, fiind posibilă formarea unui neoplasm. Expansiunea clonală este consecinţa creşterii proliferării sau a reducerii morţii celulare programate prin apoptoză. O dată cu creşterea proliferării se produc modificări progresive ale comportamentului biologic al neoplasmului (Fig.6.21.). Procesul are un grad crescut de reversibilitate, o celulă iniţiată trebuind să fie expusă mai mult sau mai puţin regulat la un promotor pentru a continua să se multiplice.

Tesut normal

Celula initiata

RASPUNS REGENERATIV

Proliferare Moarte celulara Toxicitate

Hiperplazie stationara

Tumoare benigna

Fig.6.21. Conceptul promovării tumorale

3. Progresia este ultima fază a procesului carcinogen, în care expansiunea clonală a celulelor iniţiate creşte probabilitatea apariţiei unor modificări genetice suplimentare care sunt necesare pentru progresia către cancer. Această acumulare de leziuni genetice este corelată cu modificări morfologice distincte, care progresează de la leziuni pre-neoplazice la leziuni pre-maligne şi apoi maligne. Ţesuturile sănătoase pot fi invadate, apărând metastaze. Ca şi iniţierea, progresia este un proces ireversibil.

156 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

CARCINOGENE CHIMICE După mecanismul lor de acţiune, carcinogenele se clasifică în: Ø carcinogene genotoxice, care reacţionează cu ADN-ul formând aducţi ce pot iniţia transformarea neoplazică Ø carcinogene epigenetice, care nu au reactivitate chimică şi nu pot forma aducţi cu ADN-ul, dar induc în celulele ţesutului ţintă modificări care conduc indirect la transformarea neoplazică sau favorizează dezvoltarea tumorilor din celulele modificate genetic. 1. Carcinogenele genotoxice posedă grupări electrofile reactive în moleculă, sau pot fi biotransformate la metaboliţi electrofili. Au fost astfel identificate o serie de grupări responsabile de acţiunea genotoxică, sau grupări toxofore (Fig.6.22.-6.23.), care au permis realizarea de studii de relaţie structură–activitate şi elaborarea unor programe informatice pentru prevederea carcinogenităţii noilor compuşi. Marea majoritate a carcinogenelor genotoxice sunt substanţe organice de sinteză sau substanţe naturale şi, în funcţie de necesitatea sau nu a bioactivării, sunt subclasificate în carcinogene primare, sau cu acţiune directă, şi în pro-carcinogene.

Electrofili

H R R

C

R

N

R

N

N

OH

N

S

R

R H Ion carboniu 1

H Ion nitreniu 2

Ion diazoniu 3

Ion aziridiniu 4

Ion episulfoniu 5

Fig.6.22. Structuri electrofile ce pot reacţiona cu ADN

1.1. Carcinogenele primare sunt substanţe electrofile, care se pot lega direct de ADN sau de alte molecule. Exemple de astfel de substanţe sunt epoxizii, cum ar fi oxidul de etilen, lactonele, clorambucilul. Datorită reactivităţii lor deosebite, aceste molecule sunt adesea mai active in vitro decât in vivo.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 157 Precursori 1

1

1

CH3

CH3

CH2Cl

O

O

O

P

O

O

2 NH

O

S

CH2OH

derivati N-(hidroximetil)

CH2

CH2

alchil esteri ai acidului fosfonic

alchil esteri ai acidului sulfonic

halogenuri de alchil aromatice si alifatice substituite

NO2 6

7

1

1

H2N CH2

NO2

CH2

grupari nitro alifatice

grupari nitro aromatice

CH2

N(CH2CH2Cl)2

CH2

Cl

2

N

CH2

O

O Carbamati 3

N-cloramine

11

C

N

N

H2 C

1

CH3 N

CH2

N

O

CH2 alchil N-nitrozamine

grupari azo aromatice O

H3C

1

1

O

CH3 N

12

O

O β-propiolactone

N

2 O

epoxizi de arene

S O

O

N-oxizi aromatici 5

grupari mono si dialchilamino aromatice

HC

CH2

CH

CH

Br

1,2-dibromalcani

2 CH2

NH

CH3

C(X)4

alchil hidrazine

1

HC

N CH3

CH2

epoxizi ai alchenelor

4 NH

Br

1

O

β-propiosultone

derivati aziridinil aromatici si alifatici

X = H, F, Cl, Br, I metani halogenati

Fig.6.23. Structurile unor precursori ai grupărilor electrofile

158 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

1.2. Pro-carcinogenele sunt substanţele care necesită o bioactivare pentru a deveni carcinogene finale. Din această clasă fac parte majoritatea carcinogenelor cunoscute: hidrocarburi aromatice polinucleare (benzpiren), amine aromatice (benzidina), halogenuri alifatice (clorura de vinil), nitroderivaţi aromatici (1-nitropiren), azocoloranţi (dimetilaminoazobenzen), nitrozamine (dimetil-nitrozamina), micotoxine (aflatoxina B1), toxine din plante (alcaloizii pirolizidinici, cycasin), medicamente (ciclofosfamid, tamoxifen). Ele pot fi iniţiatori puri sau substanţe genotoxice complete, ce acţionează atât ca iniţiatori cât şi ca promotori (ex. 2-acetilaminofluorenul). 1.3. Carcinogenele anorganice includ unele metale: crom, nichel, cadmiu, cobalt, şi nemetale ca arsenul. Mecanismul lor de acţiune nu este complet elucidat, ele având atât proprietăţi genotoxice cât şi epigenetice. Astfel, se presupune că metalele pot induce leziuni oxidative ale ADN, fie prin generarea de specii reactive de oxigen în reacţii de tip Fenton, fie prin inactivarea enzimelor implicate în apărarea celulelor împotriva speciilor reactive de oxigen. De asemenea, metalele pot acţiona prin mecanism epigenetic deoarece împiedică repararea ADN-ului, pot inactiva transcripţia anumitor gene, au efecte imunosupresoare sau pot inactiva proteine supresoare de tumori, cum este proteina p53. Prin acest ultim mecanism se poate explica parţial carcinogenitatea cadmiului care, având similitudine chimică cu zincul, îl poate înlocui în anumite procese. Legarea zincului este crucială pentru stabilizarea proteinei p53 în forma „sălbatecă” activă. În prezenţa cadmiului este perturbată conformaţia proteinei, care este astfel inactivată (Fig.6.24.). 2. Carcinogenele epigenetice fac parte în general din clasa pesticidelor sintetice, a aditivilor alimentari şi a medicamentelor şi nu prezintă structurile moleculare care sunt necesare pentru a forma electrofili, neavând reactivitate faţă de ADN. Structurile lor sunt foarte diferite, ceea ce face dificilă stabilirea unor relaţii structură-activitate, şi de obicei necesită bioactivare metabolică. Efectele unui anumit compus sunt de obicei limitate la un organ sau la o anume specie. Ele produc cancer prin promovarea carcinogenezei iniţiate de carcinogenele genotoxice sau de leziunile spontane ale ADN-ului. Mecanismele prin care acţionează (Fig.6.25.) sunt diverse şi includ: - inhibarea comunicării intercelulare - inhibarea polimerizării tubulinei - inhibarea apoptozei - inducerea proliferării celulare În concluzie, carcinogenele epigenetice par să acţioneze prin stimularea diviziunii celulare şi/sau blocarea apoptozei.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 159

Supresor activ 1620

C N - Oxidare - Cadmiu - Chelatare - Deficienta de Zn

- Reducere - Zn 240

N

C

Pierderea activitatii supresoare Fig.6.24. Inactivarea proteinei supresoare de tumori p53 de către cadmiu

Carcinogenele epigenetice pot fi clasificate în mai multe grupe: 2.1. Promotorii sunt substanţe care potenţează efectul iniţiatorilor la administrare simultană sau ulterioară, după luni sau chiar ani de zile de la expunere. Ei pot favoriza producerea de tumori la nivelul: - ficatului: clordan, DDT, pentaclorofenol, fenobarbital, bifenilii polibromuraţi, bifenilii policloruraţi - rinichiului: acidul nitriloacetic - vezicii: zaharina - stomacului: butil hidroxianisolul 2.2. Modulatorii endocrini pot fi: - hormoni estrogeni: 17-estradiol, 4-hidroxi-estradiol - agonişti estrogeni: 17-etinil estradiol, dietilstilbestrol - inductori ai prolactinei - antiandrogeni: finasterid, vinclozolin - inhibitori ai tiroperoxidazei: sulfametazina

160 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

- inductori ai conjugării hormonilor tiroidieni: fenobarbital - antagonişti ai receptorilor H2: lansoprazol, omeprazol, pantoprazol

CARCINOGEN EPIGENETIC S U P R A V I E T U I R E A C E L U L E I

Leziuni spontane ale ADN

M O A R T E A

reparare replicarea ADN

C E L U L E I

reparare Mutatie silentioasa

Activarea proteinelor oncogene

Inactivarea proteinelor supresoare de tumori

TRANSFORMAREA NEOPLAZICA A CELULEI

expansiune clonala TUMOARE

Fig.6.25. Promovarea carcinogenezei de către carcinogenele epigenetice

2.3. Imunosupresoare: ciclosporina, analogi purinici 2.4. Citotoxine la nivelul ficatului, rinichiului, vezicii la şobolani, care favorizează apariţia de tumori cu localizare specifică la anumite specii de rozătoare. 2.5. Carcinogenele în stare solidă cum sunt implantele de materiale plastice, metale, sticlă, determină de obicei tumori de origine mezenchimatoasă printrun mecanism de acţiune insuficient cunoscut.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 161

2.6. Proliferatorii de peroxizomi constituie o familie de hepatocarcinogene negenotoxice active la şoarece, care includ: - medicamente hipolipemiante: clofibrat, ciprofibrat, benzafibrat, gemfibrozil - plastifianţi ca ftalatul de dietilhexil Aceste substanţe induc în ficatul de şoarece o creştere marcată a numărului de peroxizomi, însoţită de inducerea proliferării celulare, cu mărirea ficatului şi suprimarea apoptozei hepatocitelor. Efectele sunt mediate prin intermediul unui receptor, identificat în 1990, receptorul proliferator de peroxizomi alfa (PPARα). Deşi acest receptor a fost identificat atât la om cât şi la şoarece, la om nu se observă proliferarea peroxizomilor şi efect hepatocarcinogen după administrarea hipolipemiantelor. Această diferenţă de reactivitate între specii poate fi explicată prin variaţia cantitativă a receptorului şi printr-o diferenţă de secvenţă în regiunea promotoare a genelor responsabile de efectul la rozătoare.

TERATOGENEZA Teratogeneza înseamnă în traducere literară producerea de organisme monstruoase şi provine din limba greacă, de la teras sau teratos, care semnifică monstru sau minune. În diferite culturi din antichitate, apariţia copiilor neobişnuiţi sau diformi a fost atribuită unor cauze cum ar fi hibridizarea dintre oameni şi zei sau dintre oameni şi demoni. Definiţia modernă a teratogenezei este „fenomenul de apariţie a defectelor de natură structurală”, iar ştiinţa care studiază aceste defecte este teratologia, termen introdus în 1832 de către Geoffroy St. Hilaire. Efectele teratogene se încadrează în toxicitatea dezvoltării, care include efectele adverse induse înainte de atingerea vârstei adulte, adică cele care se manifestă în perioada embrionară şi fetală, dar şi după naştere. Toxicitatea reproducerii reprezintă efectele adverse ale diferiţilor agenţi asupra progeniturii şi/sau afectarea funcţiilor reproductive la masculi şi la femele. Se acceptă la ora actuală că aproximativ 2-4% din nou-născuţi prezintă un defect la naştere. Această cifră poate creşte în lunile de după naştere, când devin evidente tulburările la nivelul organelor interne sau sistemului nervos central. Mai puţin de 1% din aceste defecte pot fi atribuite consumului de medicamente, restul de 99% datorându-se unor condiţii materne cum ar fi diabetul, infecţiile, abuzul de alcool (9%), unor cauze genetice clare (20-25%), în timp ce 65% sunt de origine necunoscută. Pentru ca o substanţă chimică să fie considerată teratogenă, ea trebuie să crească semnificativ incidenţa anomaliilor (fie structurale, fie funcţionale) în rândul descendenţilor, după ce a fost administrată la unul din părinţi înainte de concepţie, femelei în timpul sarcinei, sau direct fătului în dezvoltare. Efectul advers

162 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

trebuie să se producă la doze care nu induc toxicitate severă la mamă. Compuşii care conduc la moartea embrionului sunt consideraţi mai degrabă embriotoxici decât teratogeni. Teratologia şi toxicologia dezvoltării au cunoscut o evoluţie explozivă după incidentul talidomidei. La începutul anilor 1960, în lumea întreagă s-au născut mai mult de 10.000 de copii cu defecte grave la naştere, şi în special cu tip foarte rar de malformaţie a membrelor. Indivizii afectaţi prezentau amelie (absenţa membrelor) şi focomelie (reducerea lungimii oaselor membrelor), braţele fiind afectate mai frecvent decât picioarele şi fiind atinse atât partea dreaptă cât şi cea stângă, în măsură diferită. Alte defecte observate au fost: afecţiuni cardiace congenitale, anomalii oculare, intestinale şi renale, malformaţii ale urechii externe. Studiile epidemiologice efectuate au identificat în 1961 agentul etiologic, şi anume talidomida, un sedativ-hipnotic introdus în Germania în 1956. Pentru că studiile experimentale pe specii de rozătoare şi testarea clinică evidenţiaseră lipsa unor efecte adverse şi un indice terapeutic mare (doza terapeutică 100-200 mg/zi, iar doza toxică de ordinul gramelor), medicamentul a fost utilizat pe scară largă de femeile însărcinate deoarece, în afara faptului că avea efect hipnotic, era eficient şi în combaterea senzaţiei de greaţă matinală. Acest incident a fost posibil pentru că talidomida are o acţiune teratogenă care este dependentă de specie, respectiv este teratogenă la om, la primate şi la iepuri şi nu prezintă acest efect la rozătoarele care fuseseră folosite pentru testare, şoarecii şi şobolanii. În ciuda interesului suscitat de talidomidă, mecanismul de producere a efectelor teratogene nu a fost elucidat complet nici până în prezent. Se presupune mai nou că în acest mecanism ar putea fi implicaţi produşii de hidroliză ai talidomidei, respectiv acidul ftalimidoglutaramic, care s-ar putea intercala în molecula de ADN la nivelul situsurilor bogate în guanină. Stabilirea mecanismului de acţiune prezintă interes datorită potenţialului interesant al substanţei în tratamentul eritemului nodular lepros, rejecţiei grefelor, scăderii ponderale în tuberculoză, replicării virusului HIV, cancerului. Tipuri de dezvoltare anormală Există patru manifestări ale dezvoltării anormale: - moartea - malformaţia - retardarea creşterii - anomalia funcţională Defectele structurale, sau malformaţii congenitale, sunt considerate de obicei principalul criteriu de estimare a riscului teratogen, deoarece sunt mai evidente. Totuşi, anomaliile funcţionale pot fi la fel de incapacitante şi prezintă o rată de mortalitate la fel de mare ca şi anomaliile morfologice. Defectele funcţionale sunt mai greu de corelat cu un anumit agent etiologic, deoarece între

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 163

momentul expunerii şi detectarea patologiei funcţionale se pot interpune diferiţi factori care pot masca agentul cauzator. De multe ori însă, unii teratogeni comportamentali au putut fi identificaţi deoarece efectele comportamentale însoţesc alte malformaţii congenitale. De exemplu, printre copiii cu retardare a creşterii, la 33-50% există riscul de apariţie a unor deficienţe de învăţare, iar la 26-61% din copiii cu retardare mentală au fost asociate anomalii congenitale. Printre teratogenii care induc anomalii comportamentale se numără alcoolul, metilmercurul şi plumbul. Perioadele critice pentru acţiunea agenţilor teratogeni Dezvoltarea organismului uman este un ciclu care durează întreaga viaţă. Etapele acestei dezvoltări sunt: 1) Gametogeneza care este procesul de formare a celulelor germinaleovulul şi sperma. 2) Fertilizarea constă din fuziunea gameţilor pentru a forma un zigot diploid Expunerea la unele substanţe chimice cum ar fi oxidul de etilen, etilnitrozoureea, pe o perioadă scurtă de timp (∼6 ore) imediat după fertilizare, a condus la formarea unor fetuşi malformaţi. 3) Preimplantarea implică în principal creşterea numărului de celule printro serie rapidă de diviziuni celulare, formându-se blastocitul. Se consideră că expunerea în timpul preimplantării are efecte reduse sau nule asupra creşterii sau poate produce moartea. Tratamentul cu unele substanţe în această perioadă poate conduce însă la malformaţii fetale, cum este cazul metilnitrozureei. 4) Gastrularea urmează după implantarea blastocitului în peretele uterin şi constă în formarea celor trei straturi germinale: ectoderm, mezoderm şi endoderm. Această perioadă este un preludiu al organogenezei şi este susceptibilă la acţiunea teratogenilor. Malformaţiile care apar după expunerea la unii compuşi pot fi localizate la nivelul ochiului, creierului şi feţei. 5) Organogeneza este perioada în care se formează rudimente ale principalelor structuri din organism şi durează aproximativ între săptămânile a treia şi a opta de gestaţie. Este perioada de maximă susceptibilitate la producerea de malformaţii. 6) Perioada fetală (din ziua 56 până la naştere) se caracterizează prin diferenţierea ţesuturilor, creştere şi maturare fiziologică. Expunerea în această perioadă determină cel mai probabil efecte asupra creşterii şi maturării funcţionale. Rezultatele cele mai probabile sunt anomaliile la nivelul SNC şi a organelor reproductive, incluzând deficienţe comportamentale, motorii, mentale şi scăderea fertilităţii.

164 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

La om, perioada cea mai sensibilă la acţiunea substanţelor teratogene este situată între săptămâna a treia şi luna a treia de gestaţie. Dependent de momentul precis al expunerii, pot să apară malformaţii cu anumite localizări, corelate cu stadiul de dezvoltare a organului afectat (Fig.6.26.).

Maturarea functionala Histogeneza Organogeneza

Sistemul nervos central Inima Urechea Ochii Membrele

Palatul Organele genitale

1

2

3

4

saptamani 5 6

7

8

12-16

20-38

Implantare

Perioada embrionara

Perioada fetala

Moarte prenatala

Anomalii morfologice majore

Defecte fiziologice si functionale

Fig.6.26. Secvenţa evenimentelor în dezvoltarea intrauterină la om şi perioadele sensibile pentru defectele congenitate (regiunile haşurate)

Mecanismele de iniţiere a dezvoltării anormale sunt: mutaţiile, anomaliile cromozomiale, interferenţa în procesul mitotic, interferenţa în funcţia acizilor nucleici, deficienţele nutriţionale, deficienţele energetice, modificările osmolarităţii sau modificările la nivelul membranei, inhibiţia enzimatică.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 165

Substanţe teratogene la om Principale substanţe teratogene la om sunt medicamentele, dar şi alte droguri sau compuşi din mediu. Clasele recunoscute sunt: - anticonvulsivante: hidantoine (fenitoin), primidon, dione (trimetadona), acidul valproic, carbamazepina - citostatice: agenţi alchilanţi (busulfan, ciclofosfamidă, clorambucil, mecloretamină), antimetaboliţi (aminopterin, metotrexat, citarabin) - hormoni androgeni: danazol - antitiroidiene: propiltiouracil - antibiotice aminoglicozidice: streptomicină - anticoagulante cumarinice: warfarina - acizi retinoici: izotretinoin - inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei: captopril - tetracicline - alte medicamente: dietilstilbestrol, talidomidă, penicilamină, litiu - alte substanţe: etanol, cocaină, mercurul organic

IMUNOTOXICITATEA Imunotoxicologia este o ramură a toxicologiei care studiază efectele adverse ce rezultă din interacţiunea sistemului imunitar cu xenobioticele. Imunotoxicitatea este consecinţa acţiunii directe sau indirecte a unui agent chimic sau fizic asupra sistemului imunitar. Funcţia şi componentele sistemului imunitar Sistemul imunitar are rolul de a proteja organismul împotriva infecţiilor, a proteinelor străine de organism sau a celulelor neoplazice. El este alcătuit din organele limfoide şi celulele specializate. Organele limfoide Ø primare: sunt măduva osoasă şi timusul şi au rolul de a favoriza transformarea celulelor precursoare (stem) în celulele efectoare mature. Ø secundare: sunt nodulii limfatici, splina şi ţesutul limfoid asociat mucoasei, care formează unităţi imunoreactive ce răspund la pătrunderea antigenilor. Celulele specializate sunt: Ø Limfocitele T - sunt generate în timus din celule precursoare care au migrat din măduva osoasă. Acestea reprezintă aproximativ 80% din limfocitele din sânge şi 60% din limfocitele din ţesutul limfoid periferic şi au rolul de a activa limfocitele B şi macrofagele şi de a recunoaşte antigenul legat de complexul major de histocompatibilitate. O populaţie de limfocite T a fost

166 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

implicată în combaterea celulelor infectate cu virusuri, printr-un mecanism citotoxic direct. Ø Limfocitele B sunt generate de celulele precursoare din măduva osoasă şi sunt capabile să sintetizeze şi să secrete anticorpi (imunoglobuline) care sunt de mai multe tipuri: IgM, IgA, IgD, IgG şi IgE. IgM şi majoritatea subclaselor de IgG activează complementul după legarea de antigen. Dacă acest complex antigen-anticorp este fixat pe suprafaţa unei celule străine, cum este un bacil gram-negativ, activarea va produce liza şi moartea celulei. Anticorpii IgE se pot lega de receptori specifici de pe suprafaţa mastocitelor şi a bazofilelor. Deoarece terminaţia moleculei de IgE care permite legarea antigenului rămâne disponibilă, în momentul în care acesta se cuplează cu anticorpul are loc eliberarea unor mediatori farmacologici cum ar fi histamina. Rolul major al IgE nu constă în protejarea imunitară, ci în acela de mediator al reacţiei de hipersensibilitate imediată sau anafilaxie. Ø Celulele ucigaşe naturale (NK = natural killer) sunt limfocite granulare mari, care nu conţin imunoglobuline şi care sunt capabile să lezeze anumite celule ţintă. Una din funcţiile lor este apărarea împotriva infecţiilor virale şi de asemenea pot secreta diferite limfokine, printre care interferonul. Ø Macrofagele sunt celule mononucleare fagocitare cu origine comună. Sursa principală este ţesutul hematopoetic din măduva osoasă. În afară de fagocitarea particulelor şi a eritrocitelor uzate, mai au şi funcţia de prezentare a antigenilor. Ø Celulele dendritice sunt celule fără rol fagocitar, care se găsesc în ţesuturile limfoide şi în ţesutul interstiţial al unor organe ne-limfoide, cum ar fi epiteliul. Ele au printre altele rol în proliferarea limfocitelor indusă de antigeni şi în prezentarea antigenilor limfocitelor B. Alte componente ale sistemului imunitar sunt: Ø Citokinele, care sunt mediatori ai sistemului imunitar şi sunt produse de celulele sistemului imunitar, dar şi de celulele din mediul adiacent sistemului imunitar. Ele au rol în menţinerea funcţiei imunitare normale şi în controlarea răspunsului imun la antigeni. Ø Complementul este alcătuit din proteine secretate în sânge şi în limfă, care participă în reacţiile ce mediază liza celulelor străine. Procesul de liză determină producerea de componente active biologic, care induc migrarea limfocitelor şi un răspuns inflamator. Efectele substanţelor toxice asupra sistemului imunitar Substanţele imunotoxice pot produce două tipuri de efecte (Fig.6.27.): Ø Imunosupresia, care constă în deprimarea sau inhibarea funcţiei sistemului imunitar şi care poate conduce la o creştere a susceptibilităţii la apariţia tumorilor sau a bolilor infecţioase.

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 167

Ø Stimularea răspunsului imun, care poate conduce la hipersensibilitate sau la autoimunitate.

Interactiune cu imunizarea profilactica

Cresterea sensibilitatii la infectii

pierderea supravegherii imunitare

interactiune cu raspunsurile imune

efecte endocrine

Cresterea incidentei tumorilor

stres

imunosupresie

expunere la xenobiotice

interactiune cu macromoleculele (direct sau dupa bioactivare)

conjugati ai haptenelor

disfunctii imunitare lezare tisulara

modificari ale proteinelor din organism

raspuns imun impotriva proteinelor normale

reactii autoimune reactii imune (de tip I, II, III, IV)

hipersensibilitate dupa expunerea repetata la substanta toxica

activarea complementului

leziune tisulara

Fig.6.27.Interacţiunea substanţelor imunotoxice cu sistemul imunitar

IMUNOSUPRESIA Unele medicamente sau alte xenobiotice pot inhiba funcţia sistemului imunitar, proprietate care a fost utilizată în clinică pentru a înlătura respingerea grefelor sau a transplantelor de organe. Acest efect este însă considerat toxic,

168 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

deoarece creşte susceptibilitatea la infecţii, reduce eficacitatea imunizării prin vaccinuri, favorizează dezvoltarea neoplaziei şi diseminarea cancerelor şi poate chiar facilita apariţia bolilor autoimune. Există probabil mai multe mecanisme prin care se produce imunosupresia, dar este implicată cu certitudine lezarea organelor limfoide primare sau secundare, împiedicându-se sinteza sau maturarea celulelor sistemului imunitar. Substanţe imunosupresoare pot fi: Ø Medicamente antineoplazice – agenţi alchilanţi, cum ar fi ciclofosfamida. Acestea acţionează asupra ţesuturilor cu capacitate crescută de proliferare, cum ar fi măduva osoasă şi ţesutul limfoid. Ø Hidrocarburi: hidrocarburi aromatice policiclice, hidrocarburi aromatice halogenate (bifenili policloruraţi, bifenili polibromuraţi, dioxina) Ø Metale grele, compuşi organometalici: plumb, arsen, mercur, cadmiu, compuşi organostanici Ø Pesticide: DDT, dieldrin, carbaryl, carbofuran, clordan, maneb Ø Substanţe ce pătrund pe cale inhalatorie: uretan, fumul de ţigară, azbestul, iritanţii pulmonari, gazele oxidante (O3 , SO2, NO2) Ø Solvenţi organici şi substanţe înrudite: benzen, nitrotolueni monosubstituiţi Ø Medicamente: imunosupresoarele – corticosteroizi, azatioprin, rapamicina, etc.; medicamentele utilizate în tratamentul SIDA – zidovudina (AZT), zalcitabina, stavudina Ø Droguri: canabinoide, cocaina, heroina, morfina, alcoolul Ø Siliconii STIMULAREA RĂSPUNSULUI IMUN Acest tip de răspuns la un xenobiotic este adesea denumit şi reacţie alergică sau reacţie de hipersensibilitate. Răspunsul poate să apară la nivelul unor organe diferite şi poate să fie minor (prurit cutanat), sau fatal (şocul anafilactic). Răspunsul imunotoxic are la bază o reactivitate specifică modificată a organismului. Substanţa toxică trebuie să fie recunoscută de limfocitele cu competenţă imunologică a fi străină de organism, adică antigen. Antigenii sunt în general molecule mari, cu masă peste 1000-3000 daltoni. Şi molecule mai mici, cu molecule sub 1000 Da, pot induce un răspuns imun, cu condiţia să se lege covalent de proteine cu masă moleculară mare (peste 50.000 Da). Aceste xenobiotice poartă denumirea de haptene. Aducţii cu proteinele se pot forma prin două modalităţi: reacţia directă a xenobioticului cu proteina sau formarea iniţială a unor metaboliţi electrofili, care pot reacţiona cu grupările nucleofile ale proteinelor (Fig.6.28.). Aducţii haptenelor cu proteinele au două funcţii importante: - de semnal imunogen, care stimulează proliferarea limfocitelor T

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 169

- de semnal antigenic

XENOBIOTIC detoxifiere

HIPERSENSIBILITATE

bioactivare METABOLIT REACTIV

LEZARE CELULARA/TISULARA

CONJUGAT XENOBIOTIC-PROTEINA

ANTIGEN celula tinta

IMUNOGEN

ACTIVARE IMUNA

ANTICORPI IgE AUTOANTICORPI LIMFOCITE-T

Fig.6.28. Implicarea haptenelor în reacţiile de hipersensibilitate

Un număr redus de substanţe, cum ar fi penicilinele, cefalosporinele şi citostaticele, pot interacţiona direct cu grupările nucleofile ale proteinelor în condiţii fiziologice. În cazul penicilinei, răspunsul anafilactic nu este dirijat împotriva penicilinei ca atare, ci împotriva unor determinanţi haptenici care se formează prin reacţia penicilinei cu proteinele (Fig. 6.29.). Determinantul antigenic major este restul peniciloil. Deşi ciclul β-lactamic poate reacţiona direct cu grupările lizină din proteine, penicilina poate suferi o rearanjare intramoleculară la acid penicilenic, care nu numai că este mai reactiv decât penicilina ca atare, dar şi mai imunogen. S-a demonstrat că legarea a mai puţin de 0,1 din doza de penicilină administrată poate provoca un răspuns prin IgG. Antigenul interacţionează cu sistemul imunitar în două etape (Fig.6.30.): Ø Etapa de sensibilizare care presupune expunerea iniţială la antigen. Acesta este recunoscut de către sistemul imunitar ca fiind străin, şi organismul va răspunde prin producerea de anticorpi sau activarea celulelor T.

170 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Ø Etapa de inducere a răspunsului imun care se declanşează după o nouă expunere la xenobiotic. Există patru tipuri de răspuns imun, primele trei fiind umorale, ce implică producerea de anticorpi, iar ultimul fiind mediat celular, prin intermediul limfocitelor T sensibilizate specific.

S CH 2

CON H O

HC

CH 3 CH 3

C

N COO H

Benzilpenicilina

S CH 2

CON H O

Determinant benzilpeniciloil

HC C

CH 3 CH 3

HN COO H

NH lys proteina

raspu ns IgE Eliberarea mediatorilor din m astocite histam in a leucotriene Sim p tom e clinice urticatie angioedem astm soc Fig.6.29. Schema reacţiei de hipersensibilitate indusă de penicilină

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 171

Tipuri de reacţii de hipersensibilitate (Fig.6.31.): Reacţia alergică de tip I (anafilaxie, hipersensibilitate imediată). În această reacţie sunt implicate cel mai adesea IgE. Ca urmare a legării antigenului de anticorpii care se găsesc fixaţi pe suprafaţa mastocitelor, sunt eliberaţi mediatori ca: histamina, serotonina, bradikinina, heparina, calicreina, prostaglandinele, care sunt responsabili de unele efecte fiziologice cum ar fi inflamaţia, edemul, vasodilataţia. Reacţia se poate manifesta la diferite nivele: aparat respirator, piele, tract gastro-intestinal, sistem vascular.

EXPUNEREA INITIALA Compusul sau metabolitul (HAPTENA)

EXPUNEREA ULTERIOARA Compusul sau metabolitul (HAPTENA)

Conjugare cu proteinele (ANTIGEN)

Conjugare cu proteinele (ANTIGEN)

Antigenul determina formarea de proteine celulare sau umorale (ANTICORPI)

REACTIA ANTIGEN-ANTICORP

Raspuns celular Fig.6.30. Mecanismul răspunsului de sensibilizare

Ø Reacţia alergică de tip II (citolitic), implică reacţia dintre anticorpii liberi (IgG, IgA, IgM) şi antigeni legaţi de celule ca leucocitele, eritrocitele, trombocitele. Prin legarea anticorpului, celulele sunt aglutinate. Dacă ţinta este reprezentată de celulele sanguine, se pot produce discrazii sanguine. Aglutinarea poate activa complementul, determinând eliberarea de kinine, histamină, enzime lizozomale, care lezează celulele. Ø Reacţia alergică de tip III (Arthus) implică interacţiunea dintre antigeni liberi şi anticorpi liberi, in special IgG, formându-se un complex imun care poate precipita în vasele sanguine. Şi în acest caz poate fi activat sistemul complement. Depunerea complecşilor şi activarea complementului pot

172 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

conduce la tromboză, inflamaţie şi lezare vasculară. Principalele ţinte sunt: pielea, rinichii, plămânii, sistemul circulator, articulaţiile. Ø Reacţia alergică de tip IV (hipersensibilitate întârziată) este mediată celular. O membrană celulară alterată este ţinta pentru o celulă T activată (limfocită ucigaşe NK), care atacă şi distruge celula antigenică. Sunt eliberaţi mediatori ca limfokinele, care pot produce agregarea limfocitelor, macrofagelor şi bazofilelor. Ţinta poate fi reprezentată de orice organ sau ţesut, iar dacă acesta este un organ vital, consecinţele pot fi severe. În astfel de reacţii pot fi implicaţi poluanţi din mediu sau substanţe utilizate în dermatologie sau în cosmetologie.

Fig.6.31. Mecanismele de stimulare a răspunsului imun (Timbrell J.A., 1991)

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 173

Substanţe care pot produce reacţii de hipersensibilitate la diferite nivele: Ø Cardiovascular o Miocardite: antidepresive triciclice, hidroclorotiazidă, vaccinuri o Vasculite: barbiturici, cefalosporine, dapsona, griseofulvina, hidantoinul, insulina, penicilina, fenilbutazona, sulfamidele, vaccinurile, antiveninurile Ø Hematologic o Anemie hemolitică: cefalosporine, alfa-metildopa, procainamida, sulfamidele Ø Hepatic o Halotan, acid p-aminosalicilic, alfa-metildopa, sulfamide Ø Renal o Nefrite interstiţiale: meticilină, peniciline, fenitoin Ø Respirator o Astm: aspirină, cefalosporine, penicilină, sulfamide, diizotiocianaţi, anhidridă ftalică, formaldehidă, săruri de cobalt, săruri de nichel, săruri de platină Ø Piele o Dermatite de contact: benzocaină, săruri de beriliu, clorpromazină, săruri de crom, izoniazidă, neomicină, săruri de nichel, fenoli, piretrine, chinidină o Erupţii: numeroase medicamente o Exantem multiform: penicilină, salicilaţi, fenitoin, fenilbutazonă, sulfamide o Erupţii medicamentoase: barbiturici, fenolftaleină, fenilbutazonă, chinină, sulfamide, tetraciclină o Vasculite cutanate: peniciline, fenitoin, pirazolone, sulfamide o Purpură: fenitoin, chinină, chinidină, sulfamide o Eritem nodular: contraceptive o Epidermoliză: alopurinol, fenitoin, sulfamide

AUTOIMUNITATEA Termenul de autoimunitate se referă la răspunsurile autoimune şi la bolile autoimune. Răspunsurile autoimune sunt răspunsuri imune dirijate împotriva componentelor normale ale organismului, sau autoantigeni. Bolile autoimune sunt condiţii patologice în care răspunsurile imune împotriva autoantigenilor produc leziuni structurale şi /sau funcţionale. Leziunile structurale se observă atunci când

174 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

sunt prezente inflamaţia şi repararea ca urmare a acţiunii autoanticorpilor citotoxici, complexelor imune sau limfocitelor T citotoxice. Afectarea funcţională se manifestă prin stimularea (hipertrofie şi /sau hiperplazie) sau inhibarea (atrofie) celulelor ţintă ca urmare a acţiunii autoanticorpilor asupra receptorilor celulari. Autoanticorpii pot fi clasificaţi în autoanticorpi împotriva unor antigeni specifici pentru un anumit organ sau celulă (ex, anticorpi anti-eritrocite, antitiroidieni), şi în autoanticorpi împotriva unor antigeni ubicuitari, care nu au specificitate de organ (ex. anticorpi anti-ADN). Autoanticorpii pot produce leziuni prin următoarele mecanisme (Fig.6.32.): Ø 1. Liza celulelor mediată de complement, când autoanticorpii se leagă de antigenii lor fixaţi pe suprafaţa celulei şi activează complementul, producând liza celulei. Trombocitele şi eritrocitele pot fi lezate prin acest mecanism. Ø 2. Fagocitoză sau citotoxicitate – autoanticorpii favorizează fagocitoza celulelor de către macrofage şi celulele polimorfonucleare. Celulele pot fi distruse şi datorită citotoxicităţii celulare dependente de anticorp. Acest mecanism este de obicei implicat în anemia hemolitică autoimună. Ø 3. Formarea de complexe imune între autoanticorpi şi antigenii corespunzători in situ, la nivelul organului ţintă, sau în sângele în care se găsesc antigeni circulanţi. Complexele imune circulante sunt distribuite în organism şi pot afecta diferite organe cum ar fi pielea, rinichii şi vasele sanguine. În momentul în care se depun, ele activează complementul şi celulele polimorfonucleare. Leziunile sunt induse în special de mediatorii inflamatori generaţi în timpul acestor procese. Acest mecanism se observă în lupusul eritematos. Ø 4. Inhibarea sau activarea receptorilor. Autoanticorpii pot reacţiona cu receptori endogeni, producând diferite disfuncţii. De exemplu, în forma insulin-rezistentă a diabetului zaharat, autoanticorpii blochează acţiunea insulinei prin legare de receptorul acesteia. Autoanticorpii legaţi de receptorii celulari pot şi să activeze funcţia celulei, cum este cazul tireotoxicozei, când receptorul hormonului tiroidian este stimulat. Ø 5. Interacţiune cu peptidele sau proteinele. Autoanticorpii care se leagă de co-factori sau enzime pot modifica activitatea fiziologică, de exemplu absorbţia vitaminei B12 în anemia pernicioasă. Boli autoimune La ora actuală se cunosc cel puţin 30 de boli care pot fi definite ca autoimune sau care au unele manifestări autoimune. Bolile autoimune afectează aproximativ 5% din populaţia ţărilor occidentale industrializate, iar în ultimii ani se constată o creştere a frecvenţei unor maladii autoimune cum ar fi diabetul zaharat insulinodependent. Cauza acestor boli poate fi de natură infecţioasă, dar şi o serie de xenobiotice au fost implicate în producerea lor. Manifestarea lor este condiţionată

MECANISME DE ACŢIUNE TOXICĂ • 175

de o serie de factori genetici, rasiali şi hormonali şi multe din ele se observă mai frecvent la femei decât la bărbaţi. Bolile autoimune sistemice sunt: lupusul eritematos sistemic, artrita reumatoidă, polimiozita, dermatomiozita, scleroza sistemică şi vasculitele. Lupusul eritematos este probabil una din maladiile autoimune frecvent asociate cu expunerea la medicamente şi se întâlneşte mai ales la femeile tinere, fiind mai des

Fig.6.32. Patogeneza autoanticorpilor

observată la anumite grupuri etnice cum ar fi afro-caraibienii şi orientalii. Manifestările clinice includ: artrită, erupţie pe obraji şi pe nas în formă de fluture, fotosensibilitate, proteinurie, psihoză şi tulburări hematologice. În jur de 70 de medicamente au fost asociate cu inducerea unor tulburări de tip lupus eritematos, dar numai procainamida şi hidralazina au fost studiate mai aprofundat. Există dovezi care susţin implicarea şi a altor substanţe cum ar fi chinidina, carbamazepina, clorpromazina, hidrazina, izoniazida, metildopa, minociclina, penicilamina, fenitoinul. Alte boli autoimune şi xenobioticele care le induc sunt: Ø Anemia hemolitică autoimună: alfa-metildopa, penicilină, penicilamină Ø Boli tiroidiene autoimune: bifenili polibromuraţi, bifenili policloruraţi, litiu, penicilamină, amiodaron

176 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Hepatite autoimune: alfa-metildopa, oxifenacetină, halotan Glomerulonefrite prin depunere de imunocomplexe: cadmiu, aur, mercur Miastenia gravis: penicilamină, trimetadona Pemfigus: alfa-mercaptopropionilglicina, captopril, penicilamina Polimiozită: penicilamina Sclerodermie: ulei de rapiţă contaminat cu aniline, praful de siliciu, clorura de vinil.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ PATOLOGIA TOXICĂ A SISTEMULUI NERVOS Structura şi funcţia sistemului nervos Sistemul nervos este un sistem complex implicat în comunicarea intercelulară, care este alcătuit din creier, măduva spinării şi o reţea vastă de nervi şi de organe senzoriale, ce controlează funcţiile majore ale organismului. Mişcarea gândirea, vederea, auzul, vorbirea, funcţia cardiacă, respiraţia şi numeroase alte procese fiziologice, sunt controlate de această reţea complexă de procese nervoase, neuromediatori, hormoni, receptori şi canale. Sistemul nervos este separat anatomic în două componente: sistemul nervos central (SNC) şi sistemul nervos periferic (SNP). Sistemul nervos central cuprinde creierul şi măduva spinării, iar sistemul nervos periferic include nervii care vin spre sau pleacă de la măduva spinării, organele senzoriale, glande, vasele sanguine şi muşchi. Tipurile de celule din sistemul nervos Sistemul nervos este alcătuit din patru tipuri de celule: neuronii, celulele gliale (astrocite, oligodendrocite, celule ependimale), microglia şi celulele mezenchimale din compoziţia capilarelor sanguine. Neuronii sunt singurele celule excitabile din sistemul nervos, funcţia lor fiind de a transmite şi analiza informaţia. Ei sunt responsabili de primirea informaţiei senzoriale din exteriorul organismului, de integrarea şi depozitarea acesteia şi de controlarea activităţii muşchilor şi a glandelor. Un neuron (Fig.7.1.) este alcătuit dintr-un corp celular (sau pericarion), care reprezintă partea cea mai mare a celulei şi conţine nucleul, şi din axon şi dendrite. Dendritele sunt structuri ramificate, care primesc informaţia ce vine la neuroni, iar axonul, care se găseşte la partea opusă a celulei, este o structură neramificată, care conduce informaţia de la neuron. Un neuron poate avea mai multe dendrite, dar doar un singur axon. Proteinele structurale ale axonului, în special neurofilamentele şi microtubulii, sunt adesea ţinte pentru substanţele toxice. Axonul este de obicei acoperit de un strat de material lipidic ce poartă denumirea de teacă de mielină, care este o extensie a unui tip special de celule gliale ce se înfăşoară în jurul axonului. Celulele gliale a) Astrocitele sunt celulele cele mai numeroase din creierul adult. Ele au rol structural, dar şi numeroase alte funcţii: în metabolismul neuronal, în menţinerea nivelurilor de cationi care să asigure polarizarea membranei,

178 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig.7.1. Structura unui neuron (McKimm W., 2000)

în sinteza unor substanţe utilizate de neuroni, precum şi în transportul intracerebral, deoarece fac parte din bariera hemato-encefalică. b) Oligodendrocitele din sistemul nervos central sunt corespondentele celulelor lui Schwann din sistemul nervos periferic. Ambele tipuri de celule formează teaca de mielină prin înfăşurarea progresivă a citoplasmei în jurul axonului, alcătuind o structură concentrică bogată în lipide. Conţinutul ridicat în lipide favorizează trecerea compuşilor foarte lipofili din sânge spre sistemul nervos. c) Microglia este reprezentată de celule mici, care în mod normal nu se găsesc în sistemul nervos, dar al căror număr poate creşte ca răspuns la leziuni ale ţesutului. Celulele ependimale căptuşesc suprafaţa ventriculilor cerebrali. Ele nu proliferează ca răspuns la acţiunea substanţelor toxice, dar pot fi lezate în anumite condiţii care produc edem cerebral. Bariera hemato-encefalică are rolul de a proteja faţă de pătrunderea substanţelor toxice în sistemul nervos. Astrocitele formează cu celulele endoteliului capilar joncţiuni inter-celulare îngroşate, care împiedică trecerea moleculelor voluminoase

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 179

sau ionizate din sânge în creier. Fătul este parţial lipsit de bariera hematoencefalică, aceasta nefiind complet dezvoltată decât după a doua jumătate a primului an de viaţă. Sinapsa. Comunicarea inter-celulară în sistemul nervos se realizează prin intermediul sinapsei (Fig.7.2.), care este spaţiul dintre axon şi o anumită ţintă, de exemplu un alt neuron, un muşchi sau o glandă. Mesajele sunt transmise de către neuromediatori, cei mai cunoscuţi fiind: acetilcolina, catecolaminele, serotonina, acidul gama aminobutiric, glutamatul, encefalinele, endorfinele, etc. Neuromediatorii eliberaţi de axon străbat fanta sinaptică şi se leagă de receptorul post-sinaptic din celula ţintă, ceea ce conduce la un răspuns din partea acesteia. Numeroase substanţe toxice pot interfera în transmiterea impulsurilor la nivelul sinapsei.

Fig.7.2. Reprezentarea unei sinapse (Niesink, et al, 1996)

Vulnerabilitatea sistemului nervos În ciuda existenţei barierei hemato-encefalice şi a barierei nervoase periferice, sistemul nervos este deosebit de sensibil la acţiunea a numeroase substanţe toxice din mai multe motive:

180 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Ø Neuronii adulţi sunt celule care nu se divid, deci o dată pierduţi nu se pot regenera, iar leziunile sunt de obicei permanente Ø Bariera hemato-encefalică poate fi străbătută de substanţe toxice liposolubile, sau acestea pot fi transportate în creier prin mecanisme de transport activ. De asemenea, există regiuni ale sistemului nervos care sunt lipsite de această barieră. Ø Neuronii au un necesar energetic foarte ridicat, lipsa oxigenului sau a glucozei putând conduce la moartea celulară selectivă. Ø Lungimea considerabilă a axonului unor neuroni oferă o suprafaţă mare de acţiune pentru substanţele toxice. Ø Datorită excitabilităţii electrice foarte pronunţate, integritatea membranelor neuronale este afectată cu uşurinţă. Ø Deoarece funcţionarea normală a sistemului nervos necesită acţiunea unei reţele integrate complexe, lezarea chiar şi a unei mici porţiuni din sistemul nervos poate determina o afectare gravă. Ø Leziunile toxice pot progresa o dată cu înaintarea în vârstă, datorită pierderii de neuroni şi a altor modificări ce au loc treptat în a doua jumătate a vieţii. Tipuri de efecte toxice la nivelul sistemului nervos Neurotoxicitatea este definită ca orice modificare dăunătoare a structurii sau a funcţiei sistemului nervos, care apare consecutiv expunerii la o substanţă chimică. Substanţele toxice pot afecta în principal sistemul nervos central sau sistemul nervos periferic, sau pot produce fenomene neurotoxice însoţite de alterări ale altor organe şi sisteme. Efectele toxice observate sunt foarte variate (Tabel VII.1.) şi se datorează inducerii unor leziuni structurale directe sau a afectării metabolismului celulei neuronale. Leziuni structurale Leziunile structurale constau în modificarea celulelor şi a structurilor subcelulare sau în distrugerea celulelor. La nivel morfologic, substanţele toxice par să acţioneze selectiv asupra unor componente ale sistemului nervos, cum ar fi: corpul celular, axonul, teaca de mielină sau moleculele receptor de la nivelul sinapselor. Datorită incapacităţii de regenerare a sistemului nervos, expunerea la compuşi chimici poate produce o deteriorare tardivă şi progresivă. În tabelul VII.2. sunt prezentate exemple de substanţe neurotoxice şi principalele ţinte ale acţiunii lor.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 181

Tabel VII.1. Exemple de efecte neurotoxice

Efecte motorii Convulsii Slăbiciune Tremurături, tresăriri Ataxie Paralizie Reflexe anormale Efecte asupra dispoziţiei şi personalităţii Tulburări de somn Excitabilitate Depresie Iritabilitate Agitaţie Delir, halucinaţii Nervozitate, tensiune

Efecte cognitive Tulburări de memorie Confuzie Dificultăţi de vorbire Dificultăţi de învăţare Efecte senzoriale Tulburări vizuale Tulburări auditive Afectarea senzaţiei de durere Efecte generale Narcoză Oboseală Pierderea apetitului Stupoare

Afectarea metabolismului celulei neuronale Multe substanţe toxice pot produce lezarea celulelor prin interferenţă cu căile metabolice celulare. Pentru a transmite impulsurile nervoase, neuronii necesită nivele energetice ridicate, fiind deosebit de sensibili la lipsa oxigenului, şi nu sunt capabili să susţină o producere adecvată a ATP-ului. 1. Hipoxia şi ischemia Creierul nu dispune de un metabolism anaerob care să îi permită să supravieţuiască în caz de hipoxie sau anoxie, situaţie în care poate să survină coma. Anoxia totală conduce la moarte în câteva minute, datorită stopului respirator prin moarte bulbară, urmat de stop cardiac. O parte din neuroni mor înainte de încetarea completă a transportului de oxigen. Reanimarea cardiacă şi reoxigenarea tardivă nu permit reîntoarcerea la viaţă a celulelor nervoase, subiectul aflându-se în stare de moarte cerebrală. Dacă anoxia a fost doar parţială şi tratamentul s-a instituit rapid, moartea cerebrală este parţială, supravieţuind celulele care nu au suferit de pe urma anoxiei.

182 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Tabel VII.2. Substanţe neurotoxice şi ţintele acţiunii lor

Toxici la nivelul pericarionului Compuşi ai mercurului Mangan Aluminiu Glutamat Cianură MPTP Plumb Toxici la nivelul tecii de mielină Hexaclorofen Trietilstaniu Plumb Telur

Toxici la nivelul axonului n-Hexan Sulfură de carbon Taxol Colchicină Acrilamidă Piretroizi Toxici la nivelul neuromediatorilor Nicotină Compuşi organofosforici Insecticide carbamice Amfetamine Cocaină Aminoacizi excitanţi

În funcţie de mecanismul prin care se produc, hipoxiile se clasifică în: Ø A) Hipoxia anemică. Se datorează unui deficit în transportul oxigenului de către sânge ca urmare a: - blocării hemoglobinei de către substanţa toxică – de exemplu prin formarea carboxihemoglobinei, a methemoglobinei, sau a sulfhemoglobinei - hemolizei (ex. hidrogenul arseniat) Ø B) Hipoxia stagnantă. Este consecinţa unor deficienţe circulatorii şi poate să apară în cazul instalării stării de şoc. Ø C) Hipoxia hipoxică. Se poate datora unor factori externi sau interni. - Factori externi: • lipsa oxigenului din aerul inspirat • prezenţa substanţei toxice în concentraţii mari în aer = hipoxie toxică de aport - Factori interni = hipoxii toxice prin alterarea difuziei oxigenului la diferite niveluri: • blocarea centrilor bulbari de către substanţa toxică (ex. derivaţii barbiturici, morfina) • leziuni bronhopulmonare induse de edemul pulmonar

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 183

• paralizia musculaturii implicate în respiraţie (ex. meprobamatul) Ø D) Hipoxia histotoxică rezultă în urma imposibilităţii utilizării oxigenului în procesul respiraţiei celulare, ca urmare a interferenţei substanţei toxice în metabolismul celular prin blocarea unor enzime cheie ale respiraţiei celulare (ex. acidul cianhidric, hidrogenul sulfurat, care blochează citocromoxidaza). 2. Hipoglicemie şi interferenţă în procesul glicolizei În caz de hipoglicemie severă apar leziuni regionale ale creierului. Citotoxicitatea selectivă asociată hipoglicemiei a fost explicată prin mai multe mecanisme, printre care conţinutul crescut de glicogen al unor zone cerebrale, sensibilitatea mai mare a unor zone la neuromediatorii excitanţi, sau diferenţe ale necesarului energetic faţă de densitatea capilarelor în regiune, deci un aport insuficient de glucoză şi oxigen comparativ cu cererea. 3. Afectarea homeostaziei ionilor Unele substanţe toxice care produc activitate convulsivă crescută determină o pătrundere a calciului în celulă, fiind depăşită capacitatea de sechestrare a ionului în membrana plasmatică, mitocondrie sau reticulul endoplasmatic. Creşterea concentraţiei citosolice a calciului pare a fi cauza activării fosfolipazelor şi proteazelor, ceea ce conduce la lezarea celulei. Tipuri de patologii induse de substanţele toxice Nu există o clasificare standard a bolilor neurotoxice, dar cea mai frecvent întâlnită se bazează pe ţinta celulară la nivelul căreia se produce leziunea (Fig.7.3.). Astfel, se pot distinge mai multe tipuri de patologii: 1. NEURONOPATII Neuronopatiile sunt patologiile asociate cu leziuni care apar la nivelul corpului neuronal. Ele se pot explica, aşa cum s-a văzut, fie prin deficienţe nutriţionale sau respiratorii, fie prin lezarea directă a structurilor celulare. Anumite substanţe toxice acţionează specific asupra neuronilor, sau uneori asupra unui grup particular de neuroni, producând lezarea sau chiar moartea lor. Pierderea neuronului este ireversibilă şi include degenerarea tuturor extensiilor exoplasmatice, dendritele şi axonul, precum şi a tecii de mielină. Printre substanţele care lezează corpul neuronal se numără: Metilmercurul. Neurotoxicitatea acestui compus organic al mercurului a fost descoperită în mod tragic în urma unor intoxicaţii colective soldate cu numeroşi morţi în Japonia (Golful Minamata) şi în Irak. Metilmercurul reacţionează cu cisteina, formând un conjugat care mimează aminoacidul neutru

184 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig. 7.3. Tipuri de leziuni neurotoxice

metionina şi este astfel transportat activ prin bariera hemato-encefalică. Mecanismul de producere a toxicităţii nu a fost complet elucidat, dar se pare că se formează radicali liberi şi este afectată profund funcţia celulară. Consecinţa este encefalopatia difuză, unele grupe de neuroni fiind mai afectate decât altele. Distribuţia leziunilor neuronale pare a nu fi corelată cu distribuţia metilmercurului sau cu cea a ionului de mercur, ci mai degrabă cu o sensibilitate crescută a unor neuroni, cum ar fi celulele granulare din cerebel. Aluminiul poate produce o encefalopatie însoţită de degenerarea neurofibrilelor, cu manifestări asemănătoare celor din boala Alzheimer. Doxorubicina se intercalează în molecula de ADN, distrugând structura dublu elicoidală, ceea ce determină inhibarea sintezei ARN şi a proteinelor neuronale. Sensibilitatea selectivă a neuronilor faţă de alte celule poate fi corelată cu incapacitatea acestora de a repara leziunile ADN. MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahidropiridina) este un contaminant al meperidinei, sau heroina sintetică, ce produce simptome asemănătoare cu cele din boala Parkinson. După ce trece bariera hemato-encefalică, substanţa este metabolizată de MAO-B la nivelul astrocitelor, formând ionul de metil piridiniu corespunzător, MPP+. Acesta din urmă pătrunde în neuronii dopaminergici din substantia nigra prin intermediul sistemului de captare a dopaminei şi acţionează ca o toxină mitocondrială, blocând respiraţia celulară la nivelul complexului I (Fig.7.4.). Se produce în final lezarea sau moartea neuronilor.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 185

Bariera hematoencefalica

MAO-B

N

N

N

N

CH3

CH3

CH3

CH3

MPTP

Astrocite

MPDP+

MPP+

Neuroni dopaminergici

NADH

NADH DHaza

Captare activa Q10

Citocromi

O2

Mitocondrie

Fig.7.4. Activarea metabolică şi mecanismul neurotoxicităţii MPTP

Glutamatul este un neuromediator care stimulează dendritele anumitor neuroni, producând depolarizare continuă sau repetitivă a membranelor excitabile. Aceasta determină epuizarea resurselor de energie, ceea ce conduce la modificarea permeabilităţii membranei celulare, cu acumularea ionului de calciu şi în final moartea celulei. Acest mecanism este considerat a fi responsabil de aşa-numitul „sindrom al restaurantului chinezesc” produs de glutamatul de sodiu folosit ca potenţator de aromă, şi manifestat prin arsură şi mâncărime la nivelul feţei, gâtului şi părţii superioare a corpului.

186 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

2. AXONOPATII Axonopatiile sunt tulburările de origine toxică în care locul principal de acţiune a substanţei toxice este axonul. Axonul degenerează, la fel şi teaca de mielină, dar corpul neuronal rămâne intact. Axonopatiile pot fi clasificate în: - a) Axonopatiile proximale, care se produc la nivelul bazei axonului şi în prima porţiune a axonilor mielinizaţi. Această porţiune a axonului este mai vulnerabilă, datorită capacităţii sale de a genera şi propaga potenţialele de acţiune şi a capacităţii de a sintetiza proteine. Acest tip de axonopatii este rar întâlnit. - b) Axonopatiile distale sunt cel mai frecvent întâlnite. Axonopatiile distale pot fi considerate ca o secţionare chimică a axonului, partea acestuia situată distal faţă de leziune fiind separată biologic de corpul celular, ceea ce conduce la degenerare. Axonii mai lungi sunt mai susceptibili să sufere astfel de leziuni. Regenerarea poate avea loc atunci când leziunile se limitează la nervii periferici şi poate fi completă în axonopatiile în care poate fi identificat şi îndepărtat evenimentul iniţial. Pe plan clinic, axonopatiile toxice sunt asociate cu slăbiciune musculară la nivelul extremităţilor şi cu ataxie. Ele mai sunt denumite şi nevrite (polinevrite, dacă afectează mai mulţi nervi) sau neuropatii periferice, iar în cazurile grave evoluează cu parestezii (furnicături şi amorţeală), durere, anestezie, pierderea reflexelor, hipotonie, pareză şi în final paralizie şi atrofie. Şi substanţele toxice care produc carenţe vitaminice (B1, B6) pot induce polinevrite. Unele substanţe toxice ce sunt responsabile de producerea axonopatiilor distale sunt prezentate în Tabelul VII.3..

Tabelul VII.3. Substanţe toxice care pot induce axonopatii distale Acrilamida n-Hexanul p-Bromfenilacetilureea Zinc piridintiona Triortocresil fosfatul Esterii organofosforici

Izoniazida Sulfura de carbon Disulfiramul Leptofos γ-Dicetonele

Acrilamida este un monomer vinilic solubil în apă care are numeroase aplicaţii în industria chimică şi în extragerea minereurilor. Este toxică numai ca monomer, nu şi după polimerizare. Se crede că toxicitatea se datorează inhibării producerii de energie la nivelul axonului, modificării vitezei şi cantităţii

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 187

transportului şi a depunerii materialelor transportate din corpul celular, precum şi afectării structurii şi funcţiei citoscheletului. Modificările la nivelul axonului se produc numai după expunerea cronică, ceea ce sugerează faptul că nu axonul este ţinta primară a acţiunii neurotoxice a acrilamidei. γ-Dicetonele sunt metaboliţi ai n-hexanului şi ai n-butil cetonei, substanţe utilizate pe scară largă în industrie, în special în producerea de încălţăminte, şi care intră în compoziţia adezivilor. Axonopatia se instalează lent şi nu este complet reversibilă după întreruperea expunerii. În expunerea cronică se observă apariţia la nivelul axonilor a unor umflături determinate de agregarea neurofilamentelor, sistemul nervos central şi cel periferic fiind afectate concomitent. Mecanismul probabil constă în formarea, prin oxidare sub acţiunea citocromului P450, a unui metabolit γ-dicetonic ce se poate cicliza în prezenţa unei grupări aminice, rezultând un compus pirolic. În acest mod se produce o inhibiţie ireversibilă a terminaţiilor aminice (lizină) ale proteinelor fibrilare din axon (Fig.7.5.). Sulfura de carbon se utilizează ca solvent în diferite industrii şi mai ales pentru obţinerea mătăsii artificiale. Ea produce o axonopatie care implică atât fibrele senzitive cât şi cele motorii, mecanismul de acţiune fiind asemănător cu cel al n-hexanului, respectiv presupune metabolizarea la ditiocarbamaţi şi formarea unor legături covalente între neurofilamente. Izoniazida produce în expunerea cronică degenerarea nervilor periferici prin interferare în metabolismul vitaminei B6 . Astfel, ea reacţionează cu piridoxal fosfatul, formând o hidrazonă (Fig. 7.6.) care este un inhibitor puternic al piridoxal fosfat kinazei. Hidrazona are o afinitate mult mai mare pentru enzimă decât substratul normal, piridoxalul, consecinţa fiind depleţia ţesuturilor de piridoxal fosfat. Acest cofactor este deosebit de important în ţesutul nervos, fiind implicat în reacţiile de decarboxilare şi transaminare, iar rezultatul este instalarea unei polinevrite cu caracter senzitiv. Esterii organofosforici includ o serie de insecticide şi de aditivi utilizaţi în masele plastice şi în produsele petroliere, care inhibă acetilcolinesteraza, inducând o creştere a activităţii colinergice. Triortocresil fosfatul produce axonopatie distală care nu este însoţită însă de fenomene colinergice. Aceste substanţe induc o polineuropatie tardivă, caracterizată prin degenerarea axonilor lungi, cu diametru mare, din sistemul nervos central şi din cel periferic. Se crede că molecula ţintă care intervine în inducerea acestei neuropatii este o proteină neuronală cu activitate esterazică, a căreia activitate la nivel cerebral după administrare acută a fost bine corelată cu activitatea la nivelul leucocitelor, acestea din urmă fiind considerate biomarkeri adecvaţi ai posibilităţii de apariţie a afectării cerebrale. Unii inhibitori ai acestei esteraze ţină a neuropatiei, cum ar fi carbamaţii şi tiocarbamaţii, care nu produc polineuropatie tardivă, pot preveni apariţia acesteia dacă sunt administraţi înainte de compuşii organofosforici, fenomen denumit promovarea axonopatiilor.

188 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Mecanismul promovării pare a fi diferit de cel implicat în progresia leziunilor iniţiale.

H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 hexan OFMM O

O

H3C-C-CH2-CH2-C-CH3 2,5-hexandiona RNH2 R N

R N

2,5-dimetil pirol R'SH

R'S

R'NH2

R

R

N

N

NHR'

Fig.7.5. Mecanismul de acţiune a n-hexanului asupra proteinelor neurofibrilare

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 189

C

H

O

O NHNH2

CHO CH2OP

HO

N

H3C

Izoniazida

C

N Piridoxal fosfat

NHN

C

HO

N

H3C

CH2OP

N

Hidrazona

Fig.7.6. Mecanismul de acţiune neurotoxică a izoniazidei

3. MIELINOPATII Mielina asigură izolarea electrică a proceselor neuronale, distrugerea sa conducând la afectarea severă sau la absenţa transmisiei pulsatile. Distrugerea tecii de mielină are loc consecutiv lezării directe a acesteia, sau în urma afectării selective a oligodendrocitelor sau a celulelor Schwann, care sunt responsabile de producerea mielinei în SNC şi respectiv în SNP. De asemenea, există substanţe toxice care produc o separare a lamelelor de mielină, inducând edem intramielinic. Compuşi care produc demielinizare sunt: Trietilstaniul. Compuşii organostanici sunt utilizaţi ca şi stabilizatori în polimerii de material plastic, ca şi conservanţi pentru lemn şi textile, ca fungicide, bactericide şi insecticide. Trietilstaniul produce edem cerebral cu o vacuolizare a materiei albe, dar care se extinde şi în sistemul nervos periferic, şi care poate fi atribuită separării lamelelor de mielină. Hexaclorofenul a fost adăugat în săpunuri şi în detergenţii lichizi pentru proprietăţile sale antimicrobiene. El se absoarbe prin pielea intactă şi prin membranele mucoase şi se cunosc cazuri de neurotoxicitate, în special la nounăscuţi prematuri care au fost îmbăiaţi în apă cu aceste produse pentru a evita infecţiile stafilococice. Simptomele constau în tulburări vizuale şi slăbiciune musculară, care progresează spre paralizie şi se datorează unor leziuni identice cu cele produse de trietilstaniu. Plumbul produce neuropatie periferică cu demielinizare pronunţată, fiind afectaţi în principal axonii neuronilor motori.

190 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

În cursul unor intoxicaţii care decurg cu anoxie, cum ar fi intoxicaţia cu monoxid de carbon, degenerescenţa mielinică poate îmbrăca un aspect diferit, în special la nivelul sistemului nervos central, decurgând cu un edem ce disociază învelişul mielinic şi produce vacuolizare. Fenomenul poartă denumirea de degenerescenţă spongioasă. Această anomalie poate preceda simptome retard ca sindromul post-interval, care apare la 7-21 de zile după intoxicaţia acută cu monoxid de carbon. 4. TULBURĂRI ALE TRANSMITERII IMPULSULUI NERVOS Substanţele toxice pot afecta transmiterea impulsului nervos prin acţiune: Ø A) la nivelul sinapselor ca urmare a o Modificării nivelurilor de neuromediatori o Interacţiunii cu receptorii o Interferenţei cu nucleotidele ciclice Ø B) la nivelul axonului prin o Alterarea tecii de mielină o Dereglarea balanţei ionice şi energetice. Unii compuşi, datorită similitudinii structurale cu neuromediatorii endogeni, pot mima procesele de neurotransmisie din sistemul nervos simpatic, fiind denumiţi compuşi simpatomimetici. Substanţe care pot afecta transmiterea impulsului nervos sunt prezentate în Tabelul VII.4. Tabel VII.4. Medicamente şi toxine care produc neuropatii de transmisie Medicamente şi toxine ce acţionează pre-sinaptic ACTH, corticosteroizi Azatioprin Toxina botulinică Veninul de Crotalidae Magneziul Verapamilul Medicamente şi toxine ce acţionează post-sinaptic d-Penicilamina Blocanţii neuromusculari Nicotina Insecticidele organofosforice şi carbamice Fenotiazinele

Medicamente şi toxine ce acţionează atât pre- cât şi postsinaptic Antibiotice Aminoglicozide Clindamicin Polimixine Antagonişti beta-adrenergici Clorochin Litiu Fenitoin Procainamidă Chinidină

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 191

5. MIOPATII În urma unei leziuni nervoase este afectată şi musculatura inervată de nervii respectivi. Ca urmare a acţiunii substanţei toxice, muşchiul fie nu mai primeşte stimuli şi se atrofiază, fie primeşte un stimul exagerat, este hiperpolarizat şi menţinut contractat. 6. VASCULOPATII TOXICE Uneori, o dată cu afectarea ţesutului nervos se produce şi o alterare secundară a endoteliului vaselor sanguine care îl irigă. Astfel, compuşii arsenului, aluminiului, cadmiului, mercurului, plumbului, taliului, staniului, se pot lega de grupările tiolice ale celulelor endoteliale, crescând permeabilitatea peretelui vascular. Consecinţa este ieşirea în spaţiul extracelular a sângelui, cu producerea hemoragiei, sau a plasmei, cu apariţia edemului, ceea ce conduce la encefalopatie şi moartea neuronilor. Edem cerebral mai pot produce şi substanţe ca etanolul, monoxidul de carbon şi acidul cianhidric.

PATOLOGIA TOXICĂ A FUNCŢIEI PULMONARE Principala funcţie a plămânilor este schimbul de gaze, adică furnizarea de oxigen ţesuturilor şi îndepărtarea dioxidului de carbon. Deoarece suprafaţa plămânului este foarte mare, iar volumul de aer care este implicat în acest schimb este semnificativ (în medie 10.000-20.000 l/zi pentru un adult), acest organ reprezintă principala interfaţă dintre organism şi mediu, permiţând pătrunderea oricărei substanţe toxice prezente în aer sub formă de gaze, vapori sau particule solide sau lichide de diferite dimensiuni (Tabel VII.5.). La nivelul sistemului respirator există o serie de mecanisme de apărare, cum ar fi aparatul muco-ciliar şi sistemul macrofagelor alveolare, dar acestea sunt frecvent insuficiente, permiţând producerea diferitelor tipuri de leziuni. Localizarea leziunii şi tipul acesteia este rezultatul interacţiunilor complexe între agentul toxic şi gazdă. - În ceea ce priveşte substanţa toxică, sunt importante caracteristicile fizicochimice ale acesteia, doza şi tipul de expunere, acut sau cronic. - Sub aspectul particularităţilor anatomice şi funcţionale ale plămânului, sunt importante mai multe aspecte: Ø Sistemul respirator este alcătuit dintr-o gamă largă de populaţii celulare cu compoziţie diferită şi cu răspuns diferit la factorii de stres din mediu. În plus, se pare că toate populaţiile celulare

192 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

răspund la stres atunci când o singură subpopulaţie este afectată. Astfel, nu numai compartimentele celulare care se află în contact direct cu agentul lezional sau cu un alergen vor reacţiona, ci vor avea loc modificări semnificative şi în alte compartimente. Ø Volumul sanguin circulant trece prin plămân între o dată şi de cinci ori pe minut, organul fiind astfel expus şi la substanţele toxice din circulaţia sistemică. Ø Plămânul prezintă o capacitate semnificativă de metabolizare a xenobioticelor, putând juca un rol în bioactivarea sau detoxifierea acestora. Răspunsul la substanţa toxică poate fi modulat de diferiţi factori: - Vârsta. Nou-născuţii sunt mult mai susceptibili la substanţele toxice care sunt bioactivate la nivelul plămânului, probabil corelat cu diferenţierea populaţiei celulelor ţintă şi cu inducerea sistemelor enzimatice corespunzătoare. În acelaşi timp, se pare că se manifestă o deficienţă a enzimelor de detoxifiere, a căror evoluţie urmează un tipar diferit. - Sexul pare a reprezenta un factor de diferenţiere în unele boli pulmonare umane, cum ar fi cancerul pulmonar şi reacţiile de hipersensibilitate. Se cunoaşte că bolile autoimune afectează femeile într-o proporţie mai mare decât bărbaţii. - Tipul de expunere. Expunerea la aceeaşi substanţă în mod repetat modifică răspunsul acut la leziune şi rezultatul final al proceselor de reparare. Astfel, o expunere repetată care are loc în timpul procesului de reparare declanşat de lezarea acută iniţială reduce susceptibilitatea populaţiilor celulelor ţintă la leziuni ulterioare. În schimb, dacă expunerea repetată a avut loc după încheierea procesului de reparare, efectul este contrar, adică de creştere a susceptibilităţii. Această constatare este adevărată atât pentru expunerea la gazele oxidante, cât şi la hidrocarburile bioactivate. Substanţele toxice pătrunse pe cale pulmonară pot induce efecte locale sau, după absorbţie şi distribuţie, efecte sistemice. De asemenea, căile respiratorii pot fi afectate şi atunci când substanţa a pătruns în organism pe o altă cale. A. Efecte sistemice Numeroase substanţe prezente în aerul inspirat pot fi absorbite şi transportate de sângele circulant în diferite regiuni ale organismului, unde îşi exercită efectele, cum este cazul anestezicelor generale.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 193

Tabel VII.5. Substanţe toxice pulmonare din mediu şi leziunile asociate Substanţa toxică Praf de aluminiu Amoniac Arsen Azbest Beriliu Oxid de cadmiu Clor Crom Praf de cărbune Acid fluorhidric

Oxizi de fier Nichel

Oxizi de azot Ozon Fosgen Siliciu Dioxid de sulf Talc Tetracloretilen

Sursa Materiale ceramice, vopsele, artificii Prepararea fertilizanţilor, explozibililor, amoniacului Prepararea pesticidelor, sticlei, pigmenţilor, aliajelor Minerit, construcţii, construcţii navale Extracţia minereului, materiale ceramice, aliaje Sudură, topire, produse electronice, aliaje, pigmenţi Obţinerea hârtiei, maselor plastice, a compuşilor cloruraţi Prepararea compuşilor cromului, pigmenţi pentru culori Minerit Prepararea unor substanţe chimice, materiale plastice, filme fotografice, solvenţi Sudură, prepararea oţelului, minerit, topitorii Extracţia nichelului şi topire, galvanizare

Leziunea Fibroză Iritaţie Cancer pulmonar, bronşite Azbestoză, cancer pulmonar Fibroză, cancer pulmonar Emfizem Iritaţie Cancer pulmonar Fibroză Iritaţie, edem

Fibroză

Cancerul nasului, cancer pulmonar, edem Emfizem Sudură, producerea explozibililor Emfizem Sudură, albire, dezodorizare Prepararea pesticidelor, materialelor Edem plastice Fibroză (silicoză) Minerit, cariere Iritaţie Albire, refrigerare, fumigaţii, arderea cărbunilor Industria cauciucului, cosmeticelor Fibroză Edem Curăţare la rece, degresarea metalelor

194 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

B. Efecte pulmonare 1. IRITAŢIA Iritaţia este probabil efectul cel mai frecvent sesizat al unor compuşi cum ar fi amoniacul sau clorul. Această iritaţie, în special dacă este gravă sau persistentă, determină constricţia căilor respiratorii, sau conduce la edem pulmonar şi complicaţii bacteriene. Alţi agenţi iritanţi care produc frecvent edem pulmonar sunt oxizii de azot, ozonul şi fosgenul. 2. EDEMUL PULMONAR Edemul pulmonar este o leziune de tip acut, care poate să apară ca urmare a modificării hemodinamicii la nivelul vascularizaţiei pulmonare (în insuficienţă cardiacă =edem pulmonar cardiogen, sau în lezarea acută a sistemului nervos = edem pulmonar neurogen), sau ca urmare a creşterii permeabilităţii endoteliale, datorită efectului lezional al unor substanţe toxice (Fig.7.7.). Lichidul seroalbuminos din capilare trece în spaţiul interstiţial, producând edem interstiţial, sau în spaţiul alveolar producând edem alveolar. Se reduce volumul de aer din plămân şi este profund perturbat schimbul de gaze, instalându-se insuficienţa respiratorie. Prin amestecarea acestui lichid sero-albuminos cu aerul se formează o spumă persistentă. Cel mai adesea, edemul pulmonar atrage după sine complicaţii de natură infecţioasă, care contribuie la prognosticul negativ al intoxicaţiei. Şi substanţele aflate în atmosferă sub formă de particule, cum ar fi unii compuşi ai beriliului, borului şi nichelului, pot induce apariţia edemului pulmonar. 3. ATELECTAZIA Deschiderea alveolelor pulmonare ce permite schimbul de oxigen necesită o structură biochimică particulară, care să evite adeziunea peretelui alveolar. Aceasta este surfactantul, un film bogat în lipide, care reduce tensiunea superficială la o valoare apropiată de zero. El se comportă ca un echivalent acelular al membranei şi este alcătuit din proteine fixate pe lipide. În cursul anumitor procese toxice, cum ar fi anoxia, hiperoxia, inhalarea de dioxid de carbon, surfactantul poate să dispară, producându-se o lipire a celulelor care poartă denumirea de atelectazie, sau se poate desprinde de pe suprafaţa celulară sub presiunea edemului, în acest ultim caz leziunile având un anumit grad de reversibilitate.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 195

Capilara

Interstitiu

o

o Arterial o

o

o

o o o o o

o

Venos

o o o o o

Trecerea lichidului si proteinelor prin spatiul interendotelial

o o

o

o

o o o o

o o o o

o

o

Edem interstitial o

o

o o o

Lichid si proteine o

Surfactant o

o

o

o o o o o o o o o o o o

o

o

o

o

Alveola

Edem alveolar

o o

Trecerea prin jonctiunile intercelulare dintre celulele epiteliale o o o o

o

o

Fig.7.7. Edemul pulmonar

4. PNEUMOPATIILE INTERSTIŢIALE Pneumopatiile interstiţiale constau în intoxicaţiile acute din invadarea ţesutului interstiţial de către celulele cu funcţie imunitară, ca răspuns la o stare inflamatorie sau iritativă. În intoxicaţiile cronice are loc o lezare predominantă a ţesutului interstiţial interalveolar. 5. PLEUROPATIILE TOXICE Pleuropatiile constau dintr-o îngroşare a pleurei, cazul cel mai spectaculos observându-se după inhalarea prelungită de fibre de silicat, când are loc nu numai afectarea pleurei ci şi formarea de colagen şi degenerescenţă canceroasă. 6. FIBROZA PULMONARĂ Fibroza constă într-o creştere a cantităţii de colagen din parenchimul pulmonar, însoţită de modificarea acestuia şi transformarea în ţesut fibrotic. Este o

196 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

boală gravă, în care sunt implicaţi cel mai frecvent siliciul, azbestul şi beriliul după expunere inhalatorie, şi paraquatul şi bleomicina după expunere sistemică. Silicoza, care este produsă de inhalarea dioxidului de siliciu, este iniţiată de captarea particulelor de către macrofage şi încorporarea lor în lizozomi. Consecutiv ruperii membranei lizozomale, în citoplasma macrofagelor sunt eliberate enzimele lizozomale, iar celula este digerată de propriile enzime. După liza celulei, particulele de siliciu sunt eliberate şi pot fi fagocitate de alte macrofage, reluânduse ciclul. Se pare că macrofagele lezate ar elibera unele substanţe care stimulează formarea colagenului în plămân. Atât silicoza cât şi azbestoza sunt considerate a reprezenta condiţii premaligne. Alte substanţe fibrogene sunt: praful de cărbune, caolinul, talcul, aluminiul, carbura de titan. 7. EMFIZEMUL PULMONAR Emfizemul constă din apariţia unor spaţii de aer ca urmare a dilatării alveolelor sau a dispariţiei pereţilor despărţitori. Suprafaţa de schimb al gazelor este distrusă, plămânul este dilatat şi nu mai poate realiza în mod eficient schimbul de gaze datorită pierderii ţesutului şi a capacităţii de a reţine aerul. Deşi cauza majoră a emfizemului pulmonar este fumul de ţigară, şi alte substanţe pot avea acest efect: aluminiul, oxidul de cadmiu, oxizii de azot, ozonul. 8. RĂSPUNSURI ALERGICE Acest tip de răspuns este în general indus de spori de mucegaiuri, contaminanţi bacterieni, scame de bumbac, detergenţi ce conţin enzime derivate din Bacillus subtilis. Şi unele pulberi organice pot declanşa reacţii alergice de tip I, determinând apariţia rinitei, bronhospasmului, vasodilataţiei. 9. CANCERE PULMONARE Cancerele pulmonare spontane sunt o boală destul de rară, atât la om cât şi la animale. În urmă cu mai bine de un secol, cancerul pulmonar reprezenta doar 0,5% din cancerele detectate la autopsie. La începutul secolului XX, s-a constatat o creştere dramatică a incidenţei acestei forme de cancer, mai ales după cel de-al doilea război mondial, iniţial la bărbaţi şi mai apoi şi la femei. La ora actuală, cancerul pulmonar este prima cauză de deces datorită neoplaziei maligne la bărbaţi, iar la femei începe să ia locul cancerului de sân.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 197

Studiile epidemiologice au arătat că principalul factor de risc este inhalarea fumului de ţigară. Alte substanţe capabile să inducă apariţia cancerului pulmonar sunt azbestul, arsenul, cromaţii, nichelul, uraniul. Se pare că un rol important în iniţierea procesului carcinogen, atât de către particule, cât şi de alte substanţe, îl are răspunsul inflamator al plămânului, care conduce la stres oxidativ în celulele expuse. Speciile reactive de oxigen sunt esenţiale pentru activarea proto-oncogenelor de către fibrele carcinogene. De asemenea, carcinogenii pot fi activaţi la nivel pulmonar de atacul speciilor reactive de oxigen sau al celulelor care produc aceste specii, cum sunt celulele activate de inflamaţie, macrofagele şi leucocitele polimorfonucleare. C. Efecte asupra căilor respiratorii superioare Unele substanţe, prin iritarea nervului vag, produc constricţie şi îngreunează pătrunderea aerului. Toxicii iritanţi pot induce edem laringian sau laringospasm, care au drept consecinţă asfixia. Afectarea mucusului şi a cililor vibratili de către unii compuşi toxici poate determina apariţia unor procese obstructive la nivelul bronşiilor şi bronşiolelor. Astfel, iritantele induc o hipersecreţie de mucus care face dificilă pătrunderea aerului, în timp ce dioxidul de sulf fluidifică mucusul. Oxizii de azot, de sulf, formaldehida, vaporii de cadmiu, crom, nichel, fumul de ţigară, acţionează toxic asupra celulelor ciliate, producând iniţial o paralizie a vibraţiei şi apoi dispariţia cililor, ceea ce antrenează moartea celulelor. D. Efecte pulmonare consecutiv expunerii pe o altă cale Există din ce în ce mai multe date care confirmă faptul că unele medicamente pot induce lezare pulmonară care este responsabilă de tulburări funcţionale sau chiar de decese. Reacţiile pulmonare produse de medicamente pot fi: bronhospasm, edem, hemoragie, fosfolipidoză, fibroză sau efecte asupra sistemului vascular ce irigă plămânii. Mecanismele prin care se produc aceste reacţii sunt diferite: 1. Generarea de specii reactive de oxigen Prin acest mecanism se explică toxicitatea pulmonară a unor medicamente cum sunt nitrofurantoinul şi bleomicina şi toxicitatea ierbicidului paraquat, substanţe care induc fibroză pulmonară. Aceste molecule suferă, în condiţii aerobe şi în prezenţa NADPH, o reducere cu un electron, rezultând un radical liber care reacţionează imediat cu oxigenul pentru a regenera compusul părinte şi intră astfel într-un ciclu redox, care generează specii reactive de oxigen. În cazul bleomicinei, toxicitatea pulmonară este mediată, cel puţin parţial, de formarea unui complex bleomicină-fier care generează specii toxice de oxigen. Se pare că plămânul devine

198 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

ţinta toxicităţii acestor substanţe datorită concentraţiilor crescute de oxigen de la acest nivel. Şi alte citostatice, ca ciclofosfamida şi metotrexatul, pot produce fibroză pulmonară. 2. Inducerea edemului pulmonar şi a insuficienţei respiratorii Supradozarea antidepresivelor triciclice de tipul amitriptilinei poate conduce la edem pulmonar şi sindrom de insuficienţă respiratorie. Deşi deprimarea respiraţiei a fost întâlnită în 11% din cazurile de intoxicaţie acută cu antidepresive triciclice, mecanismul responsabil de efectele pulmonare nu este încă elucidat, dar se pare că aceste substanţe ar determina o creştere a permeabilităţii endoteliului. 3. Fosfolipidoza indusă de medicamente Fosfolipidoza reprezintă o acumulare excesivă a fosfolipidelor în ţesut, însoţită de infiltrarea macrofagelor în alveole. Medicamentele care produc acest efect au anumite caracteristici structurale, care implică prezenţa unei porţiuni lipofile la un capăt al moleculei şi a unei grupări aminice cationice la celălalt capăt. Mecanismul de producere a fosfolipidozei nu este cunoscut cu certitudine, dar pare a fi direct proporţional cu gradul de acumulare a acestor substanţe în plămân. Datorită proprietăţilor fizico-chimice, ele se leagă probabil de fosfolipide şi le reduc degradarea metabolică, sau au rol direct în inhibarea fosfolipazelor. Din această clasă fac parte medicamente cu acţiune farmacologică diferită: - anorexigene: clorfentermin, cloforex, fenfluramin - antiaritmice: amiodaron - antimalarice: clorochin - neuroleptice: clorpromazin.

PATOLOGIA TOXICĂ A FICATULUI Ficatul, cel mai mare organ din organism, este adesea ţinta acţiunii substanţelor toxice. Vulnerabilitatea sa se datorează mai multor factori: Ø majoritatea xenobioticelor pătrund în organism prin tractul gastrointestinal şi, după absorbţie, sunt transportate de către vena portă în ficat, care este astfel primul organ expus la substanţele toxice Ø la nivelul ficatului se întâlneşte cea mai mare concentrare de enzime de metabolizare a xenobioticelor, iar metaboliţii activi formaţi sunt mai susceptibili să reacţioneze cu celulele adiacente locului de producere Ficatul are însă o capacitate imensă de auto-reparare şi regenerare, de aceea multe din leziuni se refac după încetarea expunerii la substanţa toxică. Totuşi, în

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 199

unele situaţii mecanismele de apărare sunt depăşite şi se instalează insuficienţa hepatică, ciroza hepatică în cazul expunerii repetate, sau cancerul hepatic. Fiziologia ficatului Structura ficatului constă din rânduri de celule hepatice (hepatocite sau celule parenchimatoase), care sunt străbătute de capilare specializate, numite sinusoide. Pereţii sinusoidelor conţin celule cu capacitate de fagocitoză, celulele Kupffer, al căror rol este de a îngloba şi distruge particulele solide, bacteriile, celulele sanguine moarte, etc. Principalul aport de sânge din ficat provine din vascularizaţia intestinală. Aceste vase, împreună cu cele care vin dinspre splină şi stomac, se unesc pentru a forma vena portă. La intrarea în ficat, vena portă se divide, irigând sinusoidele (Fig.7.8.). Sângele perfuzează ficatul şi iese prin venele hepatice, care se unesc în vena cavă inferioară, ajungând apoi în inimă. Artera hepatică asigură ficatului sângele arterial oxigenat. Acizii biliari şi multe xenobiotice trec din hepatocit în canaliculele care transportă bila şi care se unesc formând canale ce urmează ramurile venei porte. Aceste canale converg în canalul hepatic, prin care bila se varsă în duoden. Vezica biliară reţine bila până în momentul când este golită în intestin. Ficatul are trei funcţii principale: de depozitare, de metabolism şi de sinteză: - glucoza este convertită în glicogen şi este depozitată, iar atunci când apare un necesar energetic este convertită din nou în glucoză - lipidele, vitaminele liposolubile şi alte substanţe nutritive sunt depozitate în ficat - acizii graşi sunt metabolizaţi şi transformaţi în lipide, care se conjugă cu proteinele sintetizate în ficat, fiind eliberaţi în circulaţie sub formă de lipoproteine - sunt sintetizate unele proteine funcţionale, cum ar fi enzimele şi factorii de coagulare - este principalul sediu al metabolismului xenobioticelor. Tipuri de leziuni hepatice Substanţele toxice pot afecta toate funcţiile majore ale ficatului. Tipul de răspuns depinde de substanţa toxică, de doză, de populaţia celulară afectată şi de tipul de expunere, acută sau cronică (Tabel VII.6.). Şi în cazul ficatului există tot mai multe date care sugerează rolul inflamaţiei în producerea hepatotoxicităţii. Astfel, leziunea iniţială determină necroză localizată şi activează macrofagele fixate în ţesut. Acest eveniment declanşează eliberarea de produşi inflamatori, printre care şi factorul necrozant tumoral, care stimulează apoptoza şi proliferarea celulară, dar şi eliberarea sau producerea de specii reactive de oxigen.

200 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Fig.7.8. Circulaţia sanguină şi biliară în ficat (Niesink et al., 1996)

A. Leziuni citotoxice acute 1. STEATOZA Steatoza hepatică reprezintă acumularea în citoplasma celulelor parenchimului hepatic a unor vezicule de lipide, ficatul ajungând să conţină mai mult de 5% lipide. Mecanismul de producere a acestei leziuni poate fi diferit, dar în principiu este corelat cu tulburări ale sintezei sau secreţiei lipoproteinelor. Rolul steatozei în lezarea hepatică nu este clar înţeles. Infiltrarea lipidelor poate induce degenerare hepatocelulară, iar acidul valproic poate produce steatoză asociată cu letalitate. 2. DEGENERAREA PARENCHIMATOASĂ Aceasta este cea mai blândă formă de degenerare hepatică. Hepatocitele se umflă şi citoplasma prezintă granulaţii eozinofile, ca urmare a umflării mitocondriilor. Dacă lezarea este mai severă, în celule este reţinută apa, uneori chiar şi proteinele plasmatice, iar celulele hepatice se umflă considerabil. Acest tip special de

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 201

degenerare poartă denumirea de degenerare hidropică. Un exemplu de substanţă care produce un astfel de efect este halotanul Tabel VII.6. Exemple de substanţe hepatotoxice şi leziunile asociate Necroză şi steatoză Tetraclorură de carbon Cloroform Tricloretilenă Tetracloretilenă Brombenzen Tioacetamidă Etionină Colestază Clorpromazin Promazin Tioridazin Mepazin Amitriptilină Hepatite Iproniazidă Izoniazidă Imipramină 6-Mercaptopurină Carcinogeneză (la animale de experienţă) Aflatoxina B1 Alcaloizii pirolizidinici Cycasin Safrol

Dimetilnitrozamină Ciclohexilamidă Tetraciclină Paracetamol Mitomicină Puromicină Acid tanic

Fosfor Beriliu Alcool etilic Galactozamină Aflatoxină Alcaloizi pirolizidinici Acid valproic

Imipramină Diazepam Metandrolon Mestranol Estradiol

Carbazonă Clorotiazidă Metimazol Sulfanilamidă Faloidină

Metoxifluoran Papaverină Fenilbutazonă Colchicină

Halotan Zoxazolamină Indometacin Metildopa

Dimetilbenzantracen Dialchil nitrozamine Bifenili policloruraţi Clorură de vinil

Acetilaminofluoren Uretan

B. Leziuni colestatice COLESTAZA este rezultatul suprimării sau întreruperii fluxului biliar, ce poate avea cauze hepatice sau extrahepatice: Ø Inflamarea sau blocarea canalelor biliare, care conduc la reţinerea sărurilor biliare şi la acumularea bilirubinei, fapt ce poate produce icter

202 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Ø Modificarea permeabilităţii membranei hepatocitelor sau a canaliculelor biliare Diagnosticul biochimic este uşor de realizat. C. Hepatopatii cronice 1. HEPATITE CRONICE ACTIVE Acestea se caracterizează printr-o inflamaţie extinsă în zona portală şi periportală, cu infiltraţii de limfocite şi celule plasmatice, asociată adesea cu o necroză unicelulară. Sindromul apare în general dacă, după producerea unei leziuni hepatice, se continuă tratamentul cu aceste medicamente. 2. FOSFOLIPIDOZA Fosfolipidoza se caracterizează prin prezenţa unor hepatocite umflate, spumoase. Apare numai după administrare prelungită şi poate evolua la ciroză. 3. CIROZA Ciroza este o boală progresivă care se caracterizează prin depunerea de colagen în întreg ficatul. Arhitectura hepatică normală este transformată în noduli hiperplastici, cu structură anormală. Acumularea de material fibros determină modificări severe ale circulaţiei sanguine şi ale proceselor metabolice şi de detoxifiere normale. Această situaţie poate la rândul ei antrena leziuni suplimentare, putându-se ajunge la insuficienţă renală. Ciroza nu este reversibilă şi are un prognostic de supravieţuire foarte redus. Rezultă de obicei în urma expunerii cronice la substanţe chimice, printre care: etanolul, arsenul, alcaloizii pirolizidinici, vitamina A. 4. TUMORI Adenoamele hepatocelulare sunt tumori benigne, care au fost asociate cu utilizarea contraceptivelor orale. Riscul este minim, dar poate creşte cu creşterea duratei de utilizare (peste 5 ani) şi cu doza administrată. Carcinomul hepatocelular este forma tipică de tumoare hepatică primară, deşi mai pot fi observate şi angiosarcom, carcinom glandular sau carcinom nediferenţiat al celulelor hepatice. Se caracterizează printr-o mare capacitate de a produce metastaze. Substanţe care pot induce astfel de cancere, identificate în principal la animale de experienţă, sunt prezentate în Tabelul VII.6.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 203

PATOLOGIA TOXICĂ A RINICHIULUI Rinichiul este un organ extrem de complex, atât din punct de vedere anatomic cât şi fiziologic. Funcţia primară a rinichiului este excreţia produşilor de degradare, dar el are un rol important şi în reglarea homeostaziei organismului, în reglarea volumului lichidului extracelular şi a balanţei electrolitice. Alte funcţii se referă la formarea hormonilor care influenţează funcţiile metabolice, cum ar fi renina, implicată în producerea angiotensinei şi a aldosteronului, precum şi a unor prostaglandine. Substanţele toxice renale pot afecta toate aceste funcţii. Susceptibilitatea rinichiului la acţiunea substanţelor toxice Aceasta poate fi atribuită, cel puţin parţial, trăsăturilor fiziologice şi anatomice unice ale acestui organ: Ø Deşi rinichiul constituie doar aproximativ 0,5% din masa corporală, el primeşte între 20 şi 25% din fluxul cardiac, ceea ce face ca orice substanţă din circulaţia sistemică să ajungă în acest organ în cantitate relativ mare. Ø Procesele care intervin în concentrarea urinei servesc şi la concentrarea potenţialelor substanţe toxice în lichidul tubular, astfel încât concentraţii plasmatice netoxice pot conduce la concentraţii renale toxice. Ø Concentrarea progresivă a substanţelor toxice în nefron poate determina precipitarea în lumen a compuşilor relativ insolubili, producând insuficienţă renală acută ca urmare a obstrucţiei tubulare. Ø Existenţa unor sisteme de transport activ la nivelul celor trei segmente ale tubului renal poate contribui la acumularea substanţelor toxice. Astfel, la nivel renal există două sisteme de transport al anionilor: transportorul anionilor organici 1 (OAT1), care este specific pentru rinichi, şi transportorul anionilor organici 3 (OAT3), care se întâlneşte atât în rinichi, cât şi în ficat şi creier, precum şi două sisteme de transport al cationilor: transportorul cationilor organici 1 (OCT1), regăsit în rinichi şi ficat, şi transportorul cationilor organici 2 (OCT2), specific rinichiului. OAT1 a fost implicat în acumularea la nivel renal a unor substanţe nefrotoxice cum ar fi antibioticul cefalosporinic cefaloridina, sau a micotoxinei ochratoxina A, în transportul acesteia din urmă intervenind şi OAT3. Deoarece majoritatea nefrotoxinelor sunt compuşi hidrofili care ajung în rinichi sau ca substanţe părinte, sau după metabolizare în ficat, relaţia ficat-rinichi trebuie luată întotdeauna în considerare în cazul nefrotoxicităţii (Fig.7.9.). Ø Posibilitatea bioactivării compuşilor exogeni la nivel renal, datorită prezenţei unor sisteme de metabolizare a xenobioticelor, deşi în concentraţii mai reduse decât în ficat. Datorită instabilităţii unor metaboliţi reactivi, capabili să se lege covalent de macromoleculele tisulare din proximitatea locului de

204 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

activare, este posibil ca formarea lor să aibă loc mai degrabă la nivel renal decât hepatic. Ø Deoarece rinichiul se află sub controlul sistemului nervos simpatic, substanţele care acţionează direct asupra nervilor simpatici pot modifica rezistenţa vasculară la nivel renal sau secreţia de renină, afectând funcţia renală. Şi rinichiul, ca şi ficatul de altfel, prezintă o capacitate remarcabilă de regenerare.

Fig.7.9. Relaţia hepato-renală între principalii transportori prin mecanism activ

Mecanismele fiziopatologice ale proceselor nefrotoxice Deşi substanţele toxice pot leza oricare parte a nefronului, ele afectează de obicei segmentul cel mai activ din punct de vedere metabolic, şi anume tubii renali. Se întâlnesc însă şi leziuni la nivel glomerular. Leziunile se produc de obicei prin: - 1) contact de tip caustic cu pereţii diferitelor segmente ale nefronului, care determină alterarea permeabilităţii, consecinţa fiind ieşirea proteinelor şi a hematiilor sau reducerea procesului de filtrare ca urmare a formării unor zone sclerotice de ţesut cicatrial - 2) mecanisme obstructive, ca urmare a depunerii substanţei toxice, a metaboliţilor sau a unui imunocomplex în nefron sau în uretere; - 3) alterarea proceselor enzimatice locale implicate în metabolizare sau în secreţia sau reabsorbţia activă.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 205

Principalele sindroame toxice renale (Fig. 7.10.) 1. INSUFICIENŢA RENALĂ ACUTĂ Insuficienţa renală acută este una din cele mai frecvente manifestări ale lezării nefrotoxice. Ea se caracterizează prin deteriorarea bruscă a funcţiei renale, cu incapacitatea rinichiului de a menţine balanţa metabolică. Se poate datora următorilor factori: - 1. Insuficienţei acute pre-renale, cum ar fi pierderea sângelui sau lichidelor, şocului sau insuficienţei cardiace congestive - 2. Necrozei acute tubulare, care este fenomenul nefrotoxic cel mai frecvent şi este asociată cu o necroză patologică, localizată de obicei la nivelul tubilor proximali. Ea se poate datora lezării toxice directe, lezării ischemice consecutive hipoperfuziei renale sau pigmenturiei (mioglobinurie datorită rabdomiolizei sau hemoglobinurie ca urmare a hemolizei). Toxicitatea directă este cauza a aproximativ 35% din cazurile de necroză tubulară. Funcţia renală se deteriorează rapid, apărând azotemie. Evoluţia este în general trifazică, cu o fază de iniţiere ca urmare a expunerii la toxic, când se produc modificări importante ale funcţiei renale, urmată de faza de stare, caracterizată prin deprecierea continuă a funcţiei renale, şi în final, dacă leziunea nu a fost prea severă, de faza de recuperare, însoţită de proliferare celulară. - 3. Obstrucţiei tractului urinar ca urmare a cristaluriei, cum este cazul oxalatului de calciu depus în intoxicaţia cu etilenglicol - 4. Nefritei interstiţiale acute, care are similitudini clinice cu necroza tubulară acută, dar care se caracterizează printr-un infiltrat celular ce separă structurile tubulare. Majoritatea nefritelor interstiţiale acute sunt cauza hipersensibilităţii şi pot fi însoţite de reacţii alergice sistemice, cum ar fi febră, eritem sau eozinofilie. Cei mai mulţi pacienţi prezintă hematurie şi leucociturie. - 5. Vasculitelor acute, care de obicei sunt tot de natură alergică. 2. INSUFICIENŢA RENALĂ CRONICĂ Insuficienţa renală cronică este definită ca orice boală care determină scăderea progresivă a funcţiei renale pe o perioadă lungă de timp. Cauzele insuficienţei renale cronice pot fi: - 1. Nefrita interstiţială cronică. Aceasta implică distrugerea tubilor renali într-o perioadă lungă de timp, fiind însoţită de atrofie tubulară, fibroză şi un infiltrat celular variabil, uneori asociată cu necroza papilară. Tubii renali nu se pot adapta la modificarea funcţiei renale şi se produc tulburări metabolice,

206 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Arteriola aferenta

Arteriola eferenta Glomerul

Parenteral Amfotericina Antihipertensive Ciclosporine Diuretice AINS Vasculite (hipersensibilitate) Amfetamine Peniciline Sulfamide AINS Nefrita interstitiala acuta Antibacteriene beta-lactamice rifampicina vancomicina sulfamide AINS Alopurinol

Nefrita interstitiala cronica Combinatii de analgezice Metale (Pb, Cd, Be, Li, Ge) Ciclosporine Nitrozuree

Tub proximal

A N S A L U I H E N L E

Sindrom nefrotic Metale (Au, Hg) AINS Penicilamina Necroza tubulara acuta (proximala) Metale (As, Bi, Cr, Hg, U) Aminoglicozide Glicoli Anestezice fluorurate Substante de contrast Pigmenti Citostatice

Necroza tubulara acuta (distala) Amfotericina Glicoli Cisplatin

Tub distal

C A N A L C O L E C T O R

Obstructie Anticolinergice Bromcriptina Ergotamina Fluorochinolone Metotrexat Sulfamide Aciclovir

Fig.7.10. Procesele nefrotoxice majore şi segmentul din nefron implicat

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 207

cum ar fi acidoza metabolică hiperclorică, depleţia de sodiu, sau hiperkalemia în faza de debut. Fiind lezate celulele ce secretă eritropoetina, apare anemia. Se observă proteinurie moderată. - 2. Necroza papilară - 3. Glomeruloscleroza cronică 3. SINDROMUL NEFROTIC Sindromul nefrotic se caracterizează prin proteinurie masivă (mai mult de 3 g/zi la adult), hipoalbuminemie, edem şi hiperlipidemie. Mecanismul constă în lezarea barierei glomerulare care în mod normal împiedică trecerea acestor macromolecule din lumenul capilar în urină. Leziunile glomerulare pot progresa la insuficienţă renală dacă procesul patologic continuă. Substanţele toxice induc acest sindrom prin eliberarea în sânge de antigeni mascaţi sau prin dereglarea balanţei imunitare. PATOLOGIA TOXICĂ A SÂNGELUI ŞI A MĂDUVEI HEMATOFORMATOARE Substanţele toxice pot acţiona asupra sângelui prin: Ø Afectarea măduvei osoase hematoformatoare Ø Afectarea elementelor figurate din sângele circulant Ø Ambele procese. A. Afectarea hematopoezei Datorită timpului de viaţă redus al celulelor sanguine, la nivelul măduvei osoase are loc un proces intens de producere a celulelor, care este foarte sensibil la acţiunea substanţelor toxice. Proliferarea celulelor în măduva osoasă poate fi afectată de deficienţe nutriţionale, de factori imunologici, sau de efecte directe ale substanţelor toxice. Rezultatul poate fi : - o producţie anormală a elementelor figurate = displazie - o producţie scăzută = hipoplazie - inhibarea completă a producţiei = aplazie sau pancitopenie - producţia unor celule maligne, datorită modificărilor ADN. Uneori sunt afectate toate liniile celulare, alteori este afectată una singură.

208 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

1. INHIBAREA HEMATOPOEZEI Inhibarea hematopoezei are drept rezultat reducerea numărului celulelor sanguine circulante, cel mai adesea ca urmare a incapacităţii celulelor precursoare din măduvă de a produce elemente mature. 1. 1. Anemia aplastică Anemia aplastică este definită drept sindromul de pancitopenie (anemie, leucopenie, trombocitopenie), determinată de hipoplazia măduvei hematoformatoare, în care celulele hematopoetice normale sunt înlocuite de celule adipoase. În mod normal, nici în sângele periferic, nici în măduvă nu se regăsesc celule anormale. Substanţe care induc anemie aplastică sunt: cloramfenicolul, fenilbutazona, sărurile de aur, benzenul. Alte substanţe care au fost corelate cu apariţia acestei afecţiuni sunt: antitiroidienele, unele anticonvulsivante (difenilhidantoină, trimetadonă), sulfamidele, antimalaricele (mepacrin), antidiabeticele (clorpropamid, tolbutamid), lindanul, toluenul. 1.2. Aplazia hematiilor se caracterizează prin anemie şi este observată consecutiv unor infecţii virale, în special cu membri ai familiei parvovirusurilor, dar şi după administrarea unor medicamente şi substanţe chimice. Patogeneza bolii nu este cunoscută. 1.3. Aplazia liniei albe produce în general o reducere semnificativă a numărului granulocitelor, însoţită de creşterea sensibilităţii la infecţii. 1.4.Absenţa megacariopoezei conduce la trombocitopenie însoţită de tendinţă crescută de apariţie a hemoragiilor cu diferite localizări: piele, rinichi, retină, creier. 2. BOLI MALIGNE ALE SÂNGELUI 2.1. Leucemia acută se caracterizează printr-o acumulare de celule medulare tinere (mieloblaşti, promielocite, monoblaşti, limfoblaşti) la nivelul măduvei hematoformatoare şi de obicei şi în sânge sau chiar în alte organe. Acestea provin din mutaţia unei singure celule tinere. Proliferarea celulelor leucemice în măduvă suprimă hematopoeza normală, simptomele care se observă fiind: anemia, sensibilitatea crescută la infecţii, creşterea tendinţei de producere a hemoragiilor. În absenţa unui tratament corespunzător, decesul poate surveni în câteva săptămâni. 2.2. Leucemia cronică apare de obicei la o vârstă mai târzie şi pacienţii pot supravieţui mai mult de 10 ani fără tratament. Este aproape invariabil fatală, deoarece se transformă în leucemie acută.

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 209

2.3. Limfoamele maligne constau într-o proliferare a celulelor limfatice în nodulii limfatici sau în ţesutul limfatic extranodal. Primele semne ale bolii sunt inflamarea de obicei nedureroasă a nodulilor limfatici periferici şi boala poate evolua rapid sau poate rămâne asimptomatică perioade lungi de timp. Limfoamele maligne pot disemina în aproape toate organele, iar exemple de astfel boli sunt: boala Hodgkin, mieloamele multiple, limfoamele nonHodgkin. Substanţe care produc boli maligne ale sângelui sunt: benzenul, azbestul, oxidul de etilen, metalele grele, stirenul, clorofenolii, clorura de vinil, citostaticele, acestea din urmă în special la asociere cu radioterapia. B. Afectarea sângelui periferic Celulele cele mai afectate din sângele periferic sunt hematiile. Substanţele toxice pot produce distrugerea rapidă a celulelor din circulaţie prin hemoliză, sau pierderea funcţiei de transport al oxigenului prin acţiune asupra hemoglobinei. 1. HEMOLIZA constă în distrugerea rapidă a hematiilor din circulaţie şi poate fi intravasculară sau extravasculară. Ea se poate produce datorită: - formarii unei hemoglobine anormale - formarii unor hematii cu structură anormală a membranei - deficienţei enzimelor glicolitice - legării antigenului de membrana eritrocitară urmată de fixarea complementului şi reacţia cu anticorpii, prin intermediul complexelor imune sau datorită producerii de autoanticorpi - lezării fizice sau chimice a membranei hematiilor prin mecanism oxidativ. Substanţe care pot induce anemie hemolitică prin mecanisme neimunitare sunt: hidrogenul arseniat, sulfatul de cupru, plumbul, veninurile de şarpe sau de păianjeni. Deficitul de glucozo-6-fosfat dehidrogenază joacă de asemenea un rol important în producerea anemiilor hemolitice. 2. ACŢIUNE ASUPRA HEMOGLOBINEI Aceasta se poate produce prin: - transformarea hemoglobinei în compuşi care nu mai pot transporta oxigenul: carboxihemoglobină (CO), cianhemoglobină (HCN), methemoglobină (oxidanţi), sulfhemoglobină (H2 S), sau descompunerea hemoglobinei sub acţiunea acizilor - perturbarea sintezei hemului de către substanţe toxice cum ar fi plumbul, care produce anemie saturnină.

210 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

PATOLOGIA TOXICĂ A PIELII Pielea, care acoperă aproape în întregime corpul uman şi cel al animalelor, este expusă la numeroase substanţe chimice cum sunt: produsele cosmetice, produsele menajere, medicamentele de uz topic, poluanţii industriali. Leziunile la nivelul pielii apar în urma expunerii cutanate la substanţa toxică, sau sunt efecte ce apar consecutiv pătrunderii substanţei toxice pe o altă cale. Majoritatea compuşilor acţionează numai asupra pielii, dar unii pot să afecteze şi structurile anexe: părul, glandele sebacee, glandele sudoripare. Principalele leziuni induse de substanţele toxice la nivelul pielii sunt: 1. IRITAŢIA PRIMARĂ Iritaţia primară constă dintr-un răspuns inflamator al pielii, cu caracter local şi reversibil, ce apare în urma contactului cu o substanţă chimică care are una din următoarele caracteristici: - produce un pH diferit de cel fiziologic - are acţiune oxidantă - are acţiune deshidratantă - are acţiune degresantă Astfel de compuşi sunt acizii şi bazele caustice, solvenţii şi detergenţii. Iritaţia se produce la locul de contact, gravitatea fiind variabilă, de la hiperemie, edem sau apariţia de vezicule, până la ulceraţie. 2. COROZIUNEA Coroziunea constă din dezintegrarea sau alterarea ireversibilă a pielii în regiunea de contact cu substanţa toxică, producându-se ulcere, necroză şi cicatrici. Substanţele incriminate sunt aceleaşi ca şi în cazul iritaţiei primare, dar se găsesc în concentraţii mai mari şi timpul de contact este mai lung. 3. DERMATITELE ALERGICE Aceste leziuni se produc printr-un proces imun în care substanţa toxică acţionează ca un antigen sau o haptenă. Consecinţa este apariţia unei reacţii la locul de contact (eritem, eczemă), sau a unei urticarii generalizate. Dermatitele alergice de contact sunt diagnosticate în aproximativ 25% din bolile de piele profesionale, iar mecanismul de producere implică o reacţie imună de tip IV. Substanţe care pot produce astfel de reacţii sunt: neomicina, antihistaminicele, anestezicele locale (benzocaina), antisepticele (mertiolat)

PROCESE PATOLOGICE DE ORIGINE TOXICĂ • 211

aplicate local, unele vegetale, compuşi metalici (nichel, beriliu), coloranţi, cosmetice, produse industriale. 4. URTICARIA Urticaria este o reacţie în general locală, care apare la câteva minute sau ore de la contactul cu pielea a anumitor substanţe chimice şi care produce hiperemie şi placă urticariană ce dispare de obicei după 24 de ore. Ea se poate explica printr-un mecanism imun sau nu. Când reacţia este mediată de un mecanism imunologic, leziunea poate fi localizată sau situată şi în alte zone, şi poate fi însoţită de simptome respiratorii sau gastrointestinale şi chiar de anafilaxie. Substanţe care pot determina apariţia urticariei sunt: animale şi plante (unii peşti, usturoiul, latexul de cauciuc, lichenii, henna), unele alimente (ouă, nuci, fructe de mare), metale (clorura de cobalt, nichelul, cuprul), balsamul de Peru, salicilatul de metil, esterii acidului nicotinic, acidul benzoic, formaldehida, terebentina, aspirina, unele antibiotice. 5. LUPUSUL ERITEMATOS DE ORIGINE TOXICĂ Este o boală considerată autoimună, care se manifestă sub forma unor plăci eritematoase localizate cu predilecţie pe obraji, ce au aspectul de fluture sau de liliac. 6. REACŢII TOXICE INDUSE DE LUMINĂ Aceste reacţii implică expunerea la lumină şi se manifestă la nivel cutanat, în urma pătrunderii pe o altă cale sau a aplicării topice a substanţei toxice. După mecanismul prin care se produc, pot fi de două tipuri: fotoalergie sau fototoxicitate. 6.1. Fototoxicitatea este mai frecvent întâlnită. Substanţa toxică, în urma absorbţiei de radiaţii UV, generează specii reactive de oxigen, care la rândul lor declanşează o cascadă de reacţii ce implică activarea protein kinazei C şi a tirozin kinazei, apoi a ciclooxigenazei şi în final producerea de prostaglandine care determină apariţia unui proces inflamator la nivelul pielii. Reacţiile cutanate care se observă sunt eritemul tardiv, urmat de hiperpigmentare şi de descuamare. Substanţe care acţionează în acest mod sunt: chinolonele, clorotiazida, fenotiazinele, unele sulfamide, derivaţii acidului aminobenzoic. 6.2. Fotoalergia presupune transformarea substanţei toxice în prezenţa luminii într-un antigen sau o haptenă. Clinic se observă uneori apariţia imediată a urticariei, în timp ce în alte cazuri apar papule sau eczeme după o perioadă de latenţă.

212 • TOXICOLOGIE GENERALĂ

Substanţe incriminate sunt : clorpromazina, prometazina, clorpropamidul, sulfanilamida, unele tiazide. Se pare că expunerea concomitentă la radiaţii UV poate favoriza şi apariţia unor cancere cutanate în cazul antibioticelor chinolonice sau a psoralenului. 7. CANCERE CUTANATE Acestea pot fi induse de substanţe de tipul gudroanelor, derivaţilor de creozot, arsenului, hidrocarburilor aromatice policiclice. 8. EFECTE ASUPRA STRUCTURILOR ANEXE ALE PIELII 8.1. Efectele asupra părului, constau în pierderea acestuia (alopecie) şi sunt determinate de citostatice, arsen, hormoni androgeni, antitiroidiene, captopril, carbamazepină, cimetidină, clorochin, hexaclorobenzen, săruri de aur, plumb, mercur, tiocianaţi, acid valproic, unele AINS. 8.2. Efectele asupra glandelor sebacee constau în general dintr-o creştere a capacităţii lor de a secreta sebumul, ceea ce conduce la apariţia acneei. Substanţele cele mai frecvent implicate sunt hidrocarburile clorurate, care produc cloroacnee după contact sau în urma expunerii sistemice.

BIBLIOGRAFIE 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

12. 13. 14. 15.

16.

17. 18. 19.

ANDERSEN H.R., NIELSEN J.B., GRANDJEAN P.: Toxicologic evidence of developmental neurotoxicity of environmental chemicals, Toxicology, 144:121-127, 2000 AQUILANTE C.L., LETRENT S.P., POLLACK G.M., BROUWER K.L.R.: Increased brain P-glycoprotein in morphine tolerant rats, Life Sciences, 66(4):47-51, 2000 BALLANTYNE B., MARRS T., TURNER P.: General & Applied Toxicology. Abridged Edition, MacMillan Press, London, 1995, p.1-1005 BARTHE L., WOODLEY J., HOUIN G.: Gastrointestinal absorption of drugs: methods and studies, Fundam.Clin.Pharmacol., 13:154-168, 1999 BAUD F.J.: Pharmacokinetic-pharmacodynamic relationships. How are they useful in human toxicology?, Toxicology Letters, 102-103:643-648, 1998 BHATNAGAR V.K., TALASKA G.: Carcinogen exposure and effect biomarkers, Toxicology letters, 108:107-116, 1999 BIGAZZI P.E.: Autoimmunity caused by xenobiotics, Toxicology, 119:1-21, 1997 BOOBIS A.R.: Interindividual variability in metabolic activation in humans in vivo, Environmental Toxicology and Pharmacology, 2:161-163, 1996 BORM P.J.A., DRISCOLL K.: Particles, inflammation and respiratory tract carcinogenesis, Toxicology Letters, 88:109-113, 1996 BOUNIAS M.: Traité de toxicologie générale, Springer-Verlag France, 1998, 777p. BURCHELL B., SOARS M., MONAGHAN G., CASSIDY A., SMITH D., ETHELL B.: Drug-mediated toxicity caused by genetic deficiency of UDP-glucuronosyltransferases, Toxicology Letters, 112-113:333-340, 2000 CALABRESE E.J.: Toxicological consequences of multiple chemical interactions: a primer, Toxicology, 105:121-135, 1995 COLLINS J.M.: Inter-species differences in drug properties, Chemico-Biological Interactions, 134:237-242, 2001 COMBES R.D.: The use of structure-activity relationships and markers of cell toxicity to detect non-genotoxic carcinogens, Toxicology in Vitro, 14:387-399, 2000 COSTA L.G., GUIZZETTI M., LU H., BORDI F., VITALONE A., TITA B., PALMERY M., VALERI P., SILVESTRINI B.: Intracellular signal transduction pathways as targets for neurotoxicants, Toxicology, 160:19-26, 2001 COSTA L.G.: Biochemical and molecular neurotoxicology: relevance to biomarker development, neurotoxicity testing and risk assessment, Toxicology Letters, 102103:417-421, 1998 COTRAU M., POPA L., STAN T., PREDA N., KINCSES-AJTAY M.: Toxicologie, Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1991, 63 p. D’ARCY P.F., MCELNAY J.C., WELLING P.G.: Mechanisms of Drug Interactions, Springer-Verlag, Berlin, 1996, 363p. D’CRUZ D.: Autoimmune diseases associated with drugs, chemicals and environmental factors, Toxicology Letters, 112-113:421-432, 2000

214 • TOXICOLOGIE GENERALĂ 20. DALY A.K., FAIRBROTHER K.S., SMART J.: Recent advances in understanding the molecular basis of polymorphism in genes encoding cytochrome P450 enzymes, Toxicology Letters, 102-103:143-147, 1998 21. EMMENDOERFFER A., HECHT M., BOEKER T., MUELLER M., HEINRICH U.: Role of inflammation in chemical-induced lung cancer, Toxicology Letters, 112113:185-191, 2000 22. ENDOU H.: Recent advances in molecular mechanisms of nephrotoxicity, Toxicology Letters, 102-103:29-33, 1998 23. EYSTER K.M.: Introduction to Signal Transduction, Biochemical Pharmacology, 55:1927-1938, 1998 24. FONNUM F., LOCK E.A.: Cerebellum as a target for toxic substances, Toxicology Letters, 112-113:9-16, 2000 25. FOURNIER E.: Toxicologie, Ellipses, Paris, 1993, 848 p. 26. GANEY P.E., ROTH R.A.: Concurrent inflammation as a determinant of susceptibility to toxicity from xenobiotic agents, Toxicology, 169:195-208, 2001 27. GHERSI-EGEA J.F., LEININGER-MULLER B., CECCHELLI R., FENSTERMACHER J.D.: Blood-brain interfaces: relevance to cerebral drug metabolism, Toxicology Letters, 82/83:645-653, 1995 28. GILGUN-SHERKI Y., MELAMED E., OFFEN D.: Oxidative stress-induced neurodegenerative diseases: the need for antioxidants that penetrate the blood brain barrier, Neuropharmacology, 40:959-975, 2001 29. GLATT H., ENGELKE C.E.H., PABEL U., TEUBNER W., JONES A.L., COUGHTRIE M.W.H., ANDRAE U., FALANY C.N., MEINL W.: Sulfotransferases: genetics and role in toxicology, Toxicology Letters, 112-113:341-348, 2000 30. GLATT H.: Sulfotransferases in the bioactivation of xenobiotics, Chemico-Biological Interactions, 129:141-170, 2000 31. GLOOR S.M., WACHTEL M., BOLLINGER M.F., ISHIHARA H., LANDMANN R., FREI K.: Molecular and cellular permeability control at the blood-brain barrier, Brain Research Reviews, 36:258-264, 2001 32. GOLDFRANK L.R., FLOMENBAUM N.E., LEWIN N.A., WEISMAN R.S., HOWLAND M.A., HOFFMAN R.S.: Goldfrank’s Toxicologic Emergencies, 6th edition, Appleton&Lange, Stamford, 1998, p.1-513 33. GUSTAFSSON J.-A.: Receptor-mediated toxicity, Toxicology Letters, 82/83:465-470, 1995 34. HALL A.H.: Computer modeling and computational toxicology in new chemical and pharmaceutical product development, Toxicology Letters, 102-103:623-626, 1998 35. HALLIDAY A.J., BARTLETT S.E., COLDITZ P., SMITH M.T: Brain region-specific studies of the excitatory behavioral effects of morphin-3-glucuronide, Life Sciences, 65(2):225-236, 1999 36. HALSTENSEN T.S.: Why we are not all allergic: basic mechanisms for tolerance development, Environmental Toxicology and Pharmacology, 4:25-31, 1997 37. HARTWIG A.: Carcinogenicity of metal compounds: possible role of DNA repair inhibition, Toxicology letters, 102-103:235-239, 1998 38. HASCHEK W.M., ROUSSEAUX C.G.: Handbook of Toxicologic Pathology, Academic Press, San Diego, 1991, 1047p. 39. HEIN D.W.: N-Acetyltransferase genetics and their role in predisposition to aromatic and heterocyclic amine-induced carcinogenesis, Toxicology Letters, 112-113:349-356, 2000

BIBLIOGRAFIE • 215 40. HELLEDAY T.: Signal Transduction, Toxicology in Vitro, 12:519-522, 1998 41. HODGSON E., LEVI P.: A Textbook of Modern Toxicology, Appleton &Lange, Stamford, 1997, 496 p. 42. HODGSON E., RYU D.-Y., ADAMS N., LEVI P.E.: Biphasic responses in synergistic interactions, Toxicology, 105:211-216, 1995 43. INGELMAN-SUNDBERG M.: Functional consequences of polymorphism of xenobiotic metabolizing enzymes, Toxicology Letters, 102-103:155-160, 1998 44. INGELMAN-SUNDBERG M.: Genetic variability in susceptibility and response to toxicants, Toxicology Letters, 120:259-268, 2001 45. IONESCU C.: Biotransformarea medicamentelor, Editura Medicala Universitara “Iuliu Hatieaganu” Cluj/Napoca, 2001, 171p. 46. JAEGER A., VALE J.A.: Intoxications aiguës, Elsevier, Paris, 1999, p.13-61 47. JAMES N.H., GILL J.H., BRINDLE R., WOODYATT N.J., MACDONALD N., ROLFE M., HASMALL S.C., TUGWOOD J.D., HOLDEN P.R., ROBERTS R.A.: Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha-regulated growth responses and their importance to hepatocarcinogenesis, Toxicology Letters, 102-103:91-96, 1998 48. JONES D.P., BROWN L.A.S., STERNBERG P.: Variability in glutathione-dependent detoxication in vivo and its relevance to detoxication of chemical mixtures, Toxicology, 105:267-274, 1995 49. KARARLI T.T.: Gastrointestinal absorption of drugs, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriers Systems, 6(1):39-86, 1989 50. KLAASEN C.D., AMDUR M.O., DOULL J.: Casarett and Doull’s Toxicology. The Basic Science of Poisons 5th edition, McGraw-Hill, New York 1996, 1111 p 51. LETRENT S.P., POLLI J.W., HUMPHREYS J.E., POLLACK G.M., BROUWER K.R., BROUWER K.L.R.: P-Glycoprotein-mediated transport of morphine in brain capillary endothelial cells, Biochemical Pharmacology, 58:951-957, 1999 52. LEWIS D.F.V., DICKINS M.: Factors influencing rates and clearance in P450mediated reactions: QSAR for substrates of the xenobiotic-metabolizing hepatic microsomal P450s, Toxicology, 170:45-53, 2002 53. LEWIS D.F.V.: On the Recognition of Mammalian Microsomal Cytochrome P450 Substrates and Their Characteristics, Biochemical Pharmacology, 60:293-306, 2000 54. LISON D.: Importance of biotransformation pathways for interpreting biological monitoring of exposure, Toxicology Letters, 108:91-97, 1999 55. LO E.H., SINGHAL A.B., TORCHILIN V.P., ABBOTT N.J.: Drug delivery to damaged brain, Brain Research Reviews, 38:140-148, 2001 56. LOOMIS T.A., HAYES A.W.: Loomis’s Essentials of Toxicology, 4th edition, Academic Press, San Diego, 1996, 263 p. 57. LOPACHIN R.M.: Redefining toxic distal axonopathies, Toxicology Letters, 112113:23-33, 2000 58. LOTTI M.: Mechanisms of toxicity and risk assessment, Toxicology Letters, 77:9-14, 1995 59. LU F.C: Basic Toxicology, 2nd edition, Hemisphere Publishing Corporation, Washington, 1991, 361 p. 60. LUSTER M.I., SIMEONOVA P.P., GALLUCCI R.M., BRUCCOLERI A., BLAZKA M.E., YUCESOY B.: Role of inflammation in chemical-induced hepatotoxicity, Toxicology Letters, 120:317-321, 2001

216 • TOXICOLOGIE GENERALĂ 61. MANSON M.M., BENFORD D.J: Factors influencing the carcinogenicity of food chemicals, Toxicology, 134:93-108, 1999 62. MARKS F., MÜLLER-DECKER K., FÜRSTENBERGER G.: A causal relationship between unscheduled eicosanoid signaling and tumor development: cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic acid metabolism, Toxicology, 153:11-26, 2000 63. MASTERS C.J.: On the Role of the peroxisome in the Metabolism of Drugs and Xenobiotics, Biochemical Pharmacology, 56:667-673, 1998 64. MATES J.M., SANCHES-JIMENEZ F.M.: Role of reactive oxygen species in apoptosis: implications for cancer therapy, International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 32:157-170, 2000 65. MCCONKEY D.J.: Biochemical determinants of apoptosis and necrosis, Toxicology Letters, 99:157-168, 1998 66. MCKIM W.A.: Drugs and Behavior. An introduction to behavioral pharmacology, 4th edition, Prentice-Hall, New Jersey, 2000, p.1-115 67. MEPLAN C., RICHARD M-J, HAINAUT P: Redox signaling and transition metals in the control of the p53 pathway, Biochemical Pharmacology, 59:25-33, 2000 68. MORETTO A.: Promoters and promotion of axonopathies, Toxicology Letters, 112113:17-21, 2000 69. NAKADATE M.: Toxicity prediction of chemicals based on structure-activity relationships, Toxicology Letters, 102-103:627-629, 1998 70. NELSON B.K.: Evidence for Behavioral Teratogenicity in Humans, Journal of Applied Toxicology, 11(1):33-37, 1991 71. NEUBERT R., MERKER H.-J., NEUBERT D.: Developmental model for thalidomide action, Nature, 400:419-420, 1999 72. NIESINK R.J.M., VRIES D., HOLLINGER M.A.: Toxicology. Principles and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1996, 1284 p. 73. OMIECINSKI C.J., HASSETT C., HOSAGRAHARA V.: Epoxide hydrolasepolymorphism and role in toxicology, Toxicology Letters, 112-113:365-370, 2000 74. OPPERMANN U.C.T., MASER E.: Molecular and structural aspects of xenobiotic carbonyl metabolizing enzymes. Role of reductases and dehydrogenases in xenobiotic phase I reactions, Toxicology, 144:71-81, 2000 75. PALLARDY M., KERDINE S., LEBREC H.: Testing strategies in immunotoxicology, Toxicology Letters, 102-103:257-260, 1998 76. PARK B.K., KITTERINGHAM N.R., POWELL H., PIRMOHAMED M.: Advances in molecular toxicology-towards understanding idiosyncratic drug toxicity, Toxicology, 153:39-60, 2000 77. PARK B.K., NAISBITT D.J., GORDON S.F., KITTERINGHAM N.R., PIRMOHAMED M.: Metabolic activation in drug allergies, Toxicology, 158:11-23, 2001 78. PLOPPER C.G., BUCKPITT A., EVANS M., VAN WINKLE L., FANUCCHI M., SMILEY-JEWELL S., LAKRITZ J., WEST J., LAWSON G., PAIGE R., MILLER L., HYDE D.: Factors modulating the epithelial response to toxicants in tracheobronchial airways, Toxicology, 160:173-180, 2001 79. RAVINDRANATH V., BHAMRE S., BHAGWAT S.V., ANANDATHEERTHAVARADA H.K., SHANKAR S.K., TIRUMALAI P.S.: Xenobiotic metabolism in brain, Toxicology Letters, 82/83:633-638, 1995

BIBLIOGRAFIE • 217 80. RAVINDRANATH V.: Metabolism of Xenobiotics in the Central Nervous System, Biochemical Pharmacology, 56:547-551, 1998 81. RENWICK A.G.: Inter-ethnic differences in xenobiotic metabolism, Environmental Toxicology and Pharmacology, 2:165-170, 1996 82. REPETTO M.: Toxicologia avanzada, Diaz de Santos, Madrid, 1995, p.87-116 83. REPETTO M.: Toxicologia fundamental, Segunda edición, Editorial cientifico-medica, Barcelona 1988, 407 p 84. RITTER J.K.: Roles of glucuronidation and UDP-glucuronosyltransferases in xenobiotic bioactivation reactions, Chemico-Biological Interactions, 129:171-193, 2000 85. ROBERTS R.A., JAMES N.H., HASMALL S.C., HOLDEN P.R., LAMBE K., MACDONALD N., WEST D., WOODYATT N.J., WHITCOME D.: Apoptosis and proliferation in nongenotoxic carcinogenesis: species differences and role of PPARα, Toxicology Letters, 112-113:49-57, 2000 86. ROZMAN K.K., DOULL J.: Dose and time as variables in toxicity, Toxicology, 144:169-178, 2000 87. SCHLEDE E., MISCHKE U., ROLL R., KAYSER D.: A national validation study of the acute-toxic-class method – an alternative to the LD50 test, Arch Toxicol, 66:455470, 1992 88. SCHOFIELD P.N., JOYCE J., LAM W.K., GRANDJEAN V., FERGUSON-SMITH A., REIK W., MAHER E.R.: Genomic imprinting and cancer; new paradigms in the genetics of neoplasia, Toxicology Letters, 120:151-160, 2001 89. SEN C.K., ROY S.: Redox control of caspases, Environmental Toxicology and Pharmacology, 10:215-220, 2001 90. SHIMODA K.: Mechanisms of quinolone phototoxicity, Toxicology Letters, 102103:369-373, 1998 91. SIMMONS J.E.: Chemical mixtures: challenge for toxicology and risk assessment, Toxicology, 105:111-119, 1995 92. SQUADRITO G.L., PRYOR W.A.: Oxidative chemistry of nitric oxide: the roles of superoxide, peroxynitrite and carbon dioxide, Free Radical Biology & Medicine, 25(4/5):392-403, 1998 93. STEPHENS T.D., BUNDE C.J.W., FILLMORE B.J.: Mechanism of Action in Thalidomide Teratogenesis, Biochemical Pharmacology, 59:1489-1499, 2000 94. STERN R.S.: Photocarcinogenicity of drugs, Toxicology Letters, 102-103:389-392, 1998 95. STERN R.S.: Photocarcinogenicity of drugs, Toxicology Letters, 102-103:389-392, 1998 96. STOPPER H., MÜLLER S.O.: Micronuclei as a Biological Endpoint for Genotoxicity: A Minireview, Toxicology in Vitro, 11:661-667, 1997 97. THOMAS S., LOWE J.E., KNOWLES R.G., GREEN I.C., GREEN M.H.L.: Factors affecting the DNA damaging activity of superoxide and nitric oxide, Mutation Research, 402:77-84, 1998 98. TIMBRELL J.A.: Principles of Biochemical Toxicology, 2nd edition, Taylor&Francis, London, 1991, 415 p. 99. TROSKO J.E., CHANG C-C., UPHAM B., WILSON M.: Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signaling leading to altered gap junctional intercellular communication, Toxicology Letters, 102-103:71-78, 1998 100. VAN BLADEREN P.J.: Glutathione conjugation as a bioactivation reaction, ChemicoBiological Interactions, 129:61-76, 2000

218 • TOXICOLOGIE GENERALĂ 101. VASILIOU V., PAPPA A., PETERSEN D.R.: Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism, Chemico-Biological Interactions, 129:1-19, 2000 102. VERDIER F., PATRIARCA C., DESCOTES J.: Autoantibodies in conventional toxicity testing, Toxicology, 119:51-58, 1997 103. VIALA A.: Eléments de Toxicologie, Tec&Doc Lavoisier, Paris, 1998, p.1-141 104. WALKER J.R., KING M., IZZO M., KOOB G.F., PASTERNAK G.W.: Antagonism of heroin and morphine self administration in rats by morphine-6β-glucuronide antagonist 3-O-methyl naltrexone, European Journal of Pharmacology, 383:115-119, 1999 105. WALKER R.: Modulation of toxicity by dietary and environmental factors, Environmental Toxicology and Pharmacology, 2:181-188, 1996 106. WEBSTER W.S., FREEMAN J.A.D.: Is this drug safe in pregnancy, Reproductive Toxicology, 15:619-629, 2001 107. WELTZIEN H.U., MOULON C., MARTIN S., PADOVAN E., HARTMANN U., KOHLER J.: T cell immune responses to haptens. Structural models for allergic and autoimmune reactions, Toxicology, 107:141-151, 1996 108. WENNING R.: Threshold values in toxicology- useful or not?, Forensic Science International, 113:323-330, 2000 109. WERMUTH C.G.: The Practice of Medicinal Chemistry, Academic Press, London, 1996, p. 615-670 110. WILLIAMS D.A., LEMKE T.L.: Foye’s Principles of Medicinal Chemistry, Lippincott Williams&Wilkins, 2002, p.174-233 111. WILLIAMS G.M., ARUOMA O.I.: Molecular Drug metabolism and Toxicology, OICA International, London, 2000, 277 p. 112. WILLIAMS G.M.: Mechanism of chemical carcinogenesis and application to human cancer risk assessment, Toxicology, 166:3-10, 2001 113. XXX: Environmental Health Criteria 212: Principles and methods for Assessing Allergic Hypersensitization Associated with Exposure to Chemicals, World Health Organization, Geneva, 1999 114. YANG R.S.H.: Some current approaches for studying combination toxicology in chemical mixtures, Food and Chemical Toxicology, 34:1037-1044, 1996 115. ZIMNIAK P., PIKULA S., BANDOROWICZ-PIKULA J., AWASTHI Y.C.: Mechanisms for xenobiotic transport in biological membranes, Toxicology Letters, 106:107-118, 1999